牛源二肽基肽酶-IV的高效制備及性質(zhì)

趙嘉妮，陳 宏，陳寅格，翁 凌，張凌晶，張志剛，林家仕，曹敏杰,,*

（1. 集美大學(xué)體育學(xué)院，福建 廈門 361021；2. 集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；3. 肉食品安全生產(chǎn)技術(shù)國家重點實驗室，福建 廈門 361100）

隨著我國國民生活方式的改變，2型糖尿病（type 2 diabetes，T2DM）患病率急劇上升。據(jù)《中國2型糖尿病防治指南（2020年版）》顯示，我國成人糖尿病患病率升至11.2%，其中T2DM占90%以上。T2DM及其并發(fā)癥是嚴(yán)重危害人類健康的慢性疾病，《2013年全球疾病負(fù)擔(dān)研究》已將糖尿病確定為預(yù)期壽命縮短的第九大原因。胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）是一種腸道來源的腸促胰島素激素，可刺激胰島素并抑制胰高血糖素分泌，二肽基肽酶IV（dipeptidyl peptidase-IV，DPP-IV）活性抑制劑就是一種可增強(qiáng)腸促胰島素作用的藥物，可用于T2DM的治療。第一種DPP-IV抑制劑類藥物西格列汀，已在2006年獲得美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)。接著，沙格列汀在2009年也被批準(zhǔn)用于治療T2DM。

DPP-IV又稱T細(xì)胞表面抗原CD26，是細(xì)胞表面的一種絲氨酸蛋白酶，約由766 個氨基酸組成，可在肝、腸、胰腺、胎盤、胸腺等多種組織和細(xì)胞類型中表達(dá)。此外，在血漿中也發(fā)現(xiàn)了這種酶的可溶形式。DPP-IV不僅在T2DM中起調(diào)節(jié)作用，在包括免疫、炎癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌功能在內(nèi)的生理過程中也起著重要作用。基于它的結(jié)構(gòu)特性，DPP-IV還具有一定的氨肽酶功能。

DPP-IV能特異性地從肽底物氨基端切去第2個位置為Pro或Ala的二肽。具有這種氨基酸序列的生理肽包括神經(jīng)肽Y、循環(huán)肽激素YY、GLP-1和胰高血糖素樣肽-2、胃抑制肽以及旁分泌趨化因子RANTES。其中，GLP-1不僅能夠刺激胰島素的分泌，還與胰腺β細(xì)胞和心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用、減少食物攝入、促進(jìn)胃排空及體重減輕有關(guān)，在降低糖尿病的形成中起著重要作用。然而，GLP-1在體內(nèi)可被DPP-IV迅速降解，超過一半進(jìn)入門靜脈循環(huán)的GLP-1在進(jìn)入體循環(huán)之前已經(jīng)被DPP-IV分解，半衰期極短。因此，抑制DPP-IV活性可防止GLP-1的降解，從而增強(qiáng)腸促胰島素的作用。更有研究表明，T2DM患者體內(nèi)的DPP-IV活性會增強(qiáng)。基于以上的生理特性，DPP-IV 被作為治療糖尿病的靶點。DPP-IV抑制劑類藥物已被證明可以降低糖化血紅蛋白水平，而不會增加低血糖和體質(zhì)量的風(fēng)險，具有良好的耐受性和安全性。該類藥物也對心血管疾病患者起到保護(hù)作用，并且可用于T2DM伴隨腎功能減退的患者。

目前，以DPP-IV為靶點酶進(jìn)行DPP-IV抑制肽的研究受到越來越多的關(guān)注。盡管早在1966年，DPP-IV就已經(jīng)在小鼠肝臟中被發(fā)現(xiàn)，迄今為止也已從多種動物組織中分離純化了DPP-IV。然而，純化過程繁瑣，酶活力低、純度不高等問題時常發(fā)生，而商品化DPP-IV大多為重組蛋白且價格昂貴（某公司重組人DPP-IV的價格為5 972.3 元/10 μg）。經(jīng)對比分析發(fā)現(xiàn)，牛DPP-IV的氨基酸序列與人DPP-IV的氨基酸序列同源性高達(dá)88.6%，具有高度相似的酶學(xué)性質(zhì)。因此，從牛組織中純化天然DPP-IV對于其抑制劑的研究有重要的實際價值。本研究以牛腎為原料，探索以較為快捷的方法分離得到高純度DPP-IV，并對其性質(zhì)進(jìn)行分析，旨在為DPP-IV及其抑制劑的深入研究提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛腎臟購于廈門市集美區(qū)菜市場。

Superdex 200 Increase 10/30GL凝膠柱 美國GE Healthcare公司；熒光底物Gly-Pro-MCA 日本Peptide Institute公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PT-2100組織搗碎機(jī) 瑞士Kinematic公司；Avanti J-26高速冷凍離心機(jī) 美國Beckman公司；恒溫水浴鍋德國Memmert公司；AKTA Basic UPC 10蛋白純化裝置 美國GE Healthcare公司；G:BOX凝膠成像儀英國Syngene公司；Chirascan圓二色譜儀 英國Applied Photophysics公司；NanoDrop-100微量蛋白核算測定儀美國Thermo Fisher Scientific公司；FP-8200熒光分光光度計 日本Jasco公司；Powerpac Basic電泳儀 美國Bio-Rad公司；M200 PRO酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 DPP-IV的分離純化

1.3.1.1 樣品前處理

從新鮮牛腎中分離皮質(zhì)（約100 g），切碎，加入300 mL的超純水，用組織搗碎機(jī)進(jìn)行搗碎后，4 ℃、10 000×離心30 min，取上清液即為粗酶液。

1.3.1.2 酸沉淀

向粗酶液中加入曲拉通（Triton X-100）至體積分?jǐn)?shù)為0.1%，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝螅?.0 mol/L鹽酸將粗酶液的pH值調(diào)至3.8。先在60 ℃水浴加熱20 min，再于37 ℃水浴加熱2 h。冰水冷卻后，4 ℃、10 000×離心30 min，取上清液。

1.3.1.3 硫酸銨鹽析

將上述上清液經(jīng)60%～85%硫酸銨溶液鹽析后，用少量20 mmol/L Tris-HCl溶液（pH 8.0）復(fù)溶沉淀，再用100 kDa濃縮管進(jìn)行濃縮，去除外液。

1.3.1.4 Superdex 200 Increase 10/300 GL凝膠柱

使用AKTA蛋白純化系統(tǒng)，將濃縮好的樣品上樣于預(yù)先經(jīng)20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）平衡好的Superdex 200 Increase 10/300 GL凝膠過濾柱。上樣結(jié)束后，用相同緩沖液進(jìn)行流洗，流速0.3 mL/min，收集流洗液，0.5 mL/管，分別測定各組分蛋白含量及酶活力。

1.3.2 蛋白質(zhì)濃度測定

DPP-IV純化過程中蛋白質(zhì)濃度用微量蛋白核酸測定儀測定，以樣品在280 nm波長處吸光度表示。

1.3.3 DPP-IV活力的測定

酶活力測定以Gly-Pro-MCA為底物，參照陳宏等的方法略作修改。方法如下：將50 μL酶與900 μL緩沖液充分混合，加入50 μL濃度為10 μmol/L的底物，37 ℃加熱30 min后立即加入1.5 mL終止液（甲醇-異丙醇-超純水35∶30∶35（/））終止反應(yīng)。用FP-8200熒光分光光度計測定反應(yīng)釋放的7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin，AMC）熒光強(qiáng)度，測定的激發(fā)波長為380 nm，發(fā)射波長為450 nm。一個酶活力單位（U）定義為每分鐘釋放1 nmol AMC所需要的酶量。

1.3.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

濃縮膠為5%，分離膠為10%，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)R250進(jìn)行染色，之后用脫色液脫色至蛋白條帶清晰，用凝膠成像系統(tǒng)記錄。

1.3.5 質(zhì)譜鑒定

對純化的酶進(jìn)行SDS-PAGE，切下目的條帶并裝入潔凈的Eppendorf管中。樣品委托深圳市微納菲生物技術(shù)有限公司進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜鑒定。

1.3.6 糖蛋白鑒定

“不僅是機(jī)械設(shè)備的零件壞了，我們會提供技術(shù)的幫助。有些大型農(nóng)機(jī)車，幾個小時就需要更換潤滑油，我們都會帶著技術(shù)人員為他們第一時間更換。”張文興說。

使用過碘酸雪夫染色（periodic acid-Schiff staining，PAS）試劑盒，鑒定DPP-IV是否為糖蛋白。

1.3.7 2D-PAGE

參考唐逸的方法，將2 mg/mL DPP-IV與水合液（7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、2% CHAPS）、1 mol/L二硫蘇糖醇（-dithiothreitol，DTT ）、兩性電解質(zhì)和溴酚藍(lán)混合，將混合液和膠條置于電泳槽中，用礦物油覆蓋，在150 V電壓下進(jìn)行等電聚焦電泳，直至結(jié)束。之后將膠條分別置于2% DTT和2.5%碘乙酰胺緩沖液中平衡20 min，再進(jìn)行SDS-PAGE。

1.3.8 非還原條件下SDS-PAGE

取蛋白樣品（2 mg/mL）加入等體積的溴酚藍(lán)上樣緩沖液混勻，10 000×離心5 min，取上清液即為樣品，之后進(jìn)行凝膠電泳。

1.3.9 二級結(jié)構(gòu)分析

在室溫下，利用圓二色譜儀對純化的DPP-IV（0.4 mg/mL）進(jìn)行掃描，掃描波長為195～255 nm，再在10～90 ℃（以5 ℃為間隔）范圍內(nèi)以1 ℃/min加熱速率測定不同溫度下DPP-IV的二級結(jié)構(gòu)，利用CDNN軟件計算該酶的熱變性溫度（）。

1.3.10 DPP-IV熱穩(wěn)定性分析

參照Pascual等的方法并略作修改。將純化的DPP-IV溶液（稀釋至200 倍）分別置于55、60、65 ℃和70 ℃水浴鍋加熱，加熱時間分別為5、10、20、30、40、50 min和60 min，取出置于冰上，取3 μL酶與67 μL緩沖液于96 孔黑色熒光板中充分混合，加入30 μL 10 μmol/L的底物，置于37 ℃反應(yīng)20 min，立即用酶標(biāo)儀測定酶活力。將不加熱酶的活力定義為100%，其他溫度下為其相對酶活力。

參照Pascual等的方法并略作修改。用不同pH值（3.0～6.0）緩沖液將純化的DPP-IV溶液稀釋至200 倍后，4 ℃下分別放置1、2、3、4、5 h和6 h后參照1.3.3節(jié)方法測定酶活力。將用20 mmol/L Tris-HCl溶液（pH 8.0）稀釋的酶活力定義為100%，計算出其他pH值下的相對酶活力。

1.3.12 金屬離子對DPP-IV活力的影響

參照酶活力測定方法，將DPP-IV溶液與不同濃度金屬離子共孵育5 min后，測定其酶活力，不加金屬離子的酶活力定義為100%，計算出金屬離子存在下的相對酶活力。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均設(shè)3 組平行，運(yùn)用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛腎皮質(zhì)DPP-IV的分離純化

為除去粗酶液中所含的部分雜蛋白及色素，在得到粗酶之后，對樣品進(jìn)行酸沉淀和硫酸銨鹽析。再利用凝膠過濾層析的方法，除去剩余的雜蛋白，分離得到純化的DPP-IV（圖1）。如圖2所示，SDS-PAGE結(jié)果表明，在經(jīng)過一系列純化過程之后，得到分子質(zhì)量約為106 kDa的單一條帶。凝膠過濾層析得到2 個蛋白峰，其中一個蛋白峰與酶活力峰相重合。純化過程如表1所示，從100 g牛腎皮質(zhì)中純化得到2.9 mg蛋白，得率為9.5%，純化倍數(shù)為169.9 倍。

圖1 DPP-IV的Superdex 200 Increase 10/300 GL凝膠過濾層析Fig. 1 Gel filtration chromatogram of DPP-IV on Superdex 200 Increase 10/300 GL

圖2 DPP-IV的SDS-PAGE（還原條件）分析Fig. 2 Reducing SDS-PAGE analysis of DPP-IV

表1 牛腎皮質(zhì)DPP-IV純化過程Table 1 Summary of purification of DPP-IV from bovine kidney

2.2 DPP-IV的質(zhì)譜鑒定

將純化的DPP-IV進(jìn)行SDS-PAGE后切膠回收，經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜鑒定。圖3為DPP-IV肽質(zhì)量指紋一級圖譜結(jié)果。表2顯示，鑒定得到12 個肽段，共517 個氨基酸殘基。圖4是肽段與家牛DPP-IV的序列比對結(jié)果，將質(zhì)譜檢測數(shù)據(jù)與NCBI數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)，其與牛（）（gi：27806655）DPP-IV的氨基酸序列高度匹配，證明純化蛋白為牛DPP-IV。

圖3 牛腎DPP-IV特有肽段一級質(zhì)譜圖Fig. 3 Mass spectrum of DPP-IV from bovine kidney

表2 牛腎DPP-IV肽段序列Table 2 Peptide sequences of DPP-IV from bovine kidney

續(xù)表2

圖4 肽段與家牛DPP-IV的序列比對Fig. 4 Peptide fragment alignment of DPP-IV from bovine kidney with that from B. taurus

2.3 牛腎皮質(zhì)DPP-IV的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.3.1 PAS染色

圖5 DPP-IV的PAS染色（A）及非還原條件下的SDS-PAGE分析（B）Fig. 5 PAS staining (A) and non-reducing SDS-PAGE analysis (B) of DPP-IV

對純化的DPP-IV進(jìn)行PAS染色，結(jié)果如圖5A所示。DPP-IV能被PAS試劑染色，而陰性對照牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）不能被染色，表明DPPIV為糖蛋白。

2.3.2 非還原條件下SDS-PAGE

對DPP-IV進(jìn)行非還原條件下SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖5B所示，純化的DPP-IV分子質(zhì)量約為210 kDa，相當(dāng)于還原條件下SDS-PAGE蛋白質(zhì)分子質(zhì)量（106 kDa）的2 倍，故推測DPP-IV在天然條件下以二聚體的形式存在。該結(jié)果與人重組DPP-IV在非還原條件下分子質(zhì)量約為240 kDa，即同樣是以二聚體的形式存在一致。

2.3.3 2D-PAGE

對DPP-IV進(jìn)行雙向電泳分析，結(jié)果如圖6所示。電泳凝膠上顯示出單一的點，其等電點約為pH 5.8，分子質(zhì)量較SDS-PAGE結(jié)果略高，推測是由于DPP-IV是糖蛋白的原因影響遷移。

圖6 牛腎DPP-IV的2D-PAGE分析Fig. 6 2D-PAGE analysis of DPP-IV from bovine kidney

2.3.4 DPPIV二級結(jié)構(gòu)分析

圓二色譜掃描結(jié)果如圖7A所示，DPP-IV具有明顯的-折疊構(gòu)象。當(dāng)溫度在70 ℃以下時，圓二色譜的特征吸收峰未發(fā)生明顯變化，隨溫度升高，正負(fù)吸收峰強(qiáng)度均增大。通過CDNN軟件分析DPP-IV二級結(jié)構(gòu)在不同溫度下相對含量變化。在70 ℃時，DPP-IV二級結(jié)構(gòu)含量無明顯變化，當(dāng)溫度達(dá)到80 ℃及以上時，DPP-IV二級結(jié)構(gòu)中，-螺旋占比逐漸升高，-折疊占比逐漸減少，DPP-IV的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變（表3）。圖7B顯示，DPP-IV熱變性溫度為（72.7±0.3）℃，說明該酶具有良好的熱穩(wěn)定性。

表3 DPP-IV二級結(jié)構(gòu)占比分析Table 3 Secondary structure composition of DPP-IV%

圖7 DPP-IV的二級結(jié)構(gòu)分析Fig. 7 Circular dichroism spectra of DPP-IV at different temperatures and determination of its denaturation temperature

2.3.5 DPP-V熱穩(wěn)定性分析

如圖8所示，當(dāng)溫度在55 ℃時，隨時間延長，DPPIV活力基本保持不變，60 ℃時酶活力略有下降，但仍能保持在80%以上。在65 ℃時，酶活力降低速度加快，70 ℃加熱20 min后，酶活力幾乎為零。說明該酶在60 ℃以下能保持相對較高的活性，當(dāng)溫度超過60 ℃時，DPP-IV活力逐漸降低，70 ℃時DPP-IV迅速失活，表明DPP-IV在60 ℃以下能夠保持較為穩(wěn)定的酶活力。

圖8 DPP-IV的熱穩(wěn)定性分析Fig. 8 Thermal stability of DPP-IV

2.3.6 DPP-IV的pH值穩(wěn)定性分析

pH值對酶促反應(yīng)速率的影響，主要是由于pH值的改變導(dǎo)致酶的催化基團(tuán)以及底物分子的解離狀態(tài)改變，或者導(dǎo)致酶蛋白的變性。如圖9所示，DPP-IV在pH 4.0、5.0、6.0時能保持較高的酶活力，在pH 3.0時，隨時間延長，酶活力略有下降，但仍能保持在80%左右，說明DPP-IV具有較好的pH值穩(wěn)定性。

圖9 DPP-IV的pH值穩(wěn)定性Fig. 9 pH stability of DPP-IV

2.3.7 金屬離子對DPP-IV活力的影響

將DPP-IV與不同金屬離子于37 ℃下共孵育5 min，之后以 Gly-Pro-MCA為底物，測定其剩余酶活力。圖10結(jié)果表明，Zn對DPP-IV具有強(qiáng)烈的抑制作用，且隨著濃度的增高抑制作用隨之增強(qiáng)，在濃度為1 mmol/L時，抑制率達(dá)到98%，其次是Fe和Fe，在1 mmol/L下對DPP-IV的抑制率接近80%。其他離子對DPP-IV的抑制作用相對較弱，即使在1 mmol/L濃度下，抑制率也都不超過40%。

圖10 不同濃度金屬離子對DPP-IV活力的影響Fig. 10 Effect of different concentrations of metal ions on DPP-IV activity

3 討 論

以牛腎為原料，分離得到純度較高的DPP-IV，經(jīng)質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)其與家牛DPP-IV的氨基酸序列相對應(yīng)，同源性為100%，證明純化的蛋白為DPP-IV。

對于DPP-IV的純化，Iwaki-Egawa等以人血清為原料，經(jīng)DEAE-Cellulose DE-52、DEAECellulofine A-800、Sephacryl S-300 HR、Butyl-Toyopearl 650S純化得到人血清DPP-IV，但需要過4次柱層析，過程繁瑣；De Meester等利用DEAE Sepharose和ADA Sepharose分別從人精漿和前列腺小體中分離得到DPP-IV。但由于人源DPP-IV的原料難以獲得，更多的研究選擇其他哺乳動物為原料進(jìn)行。先前對于哺乳動物DPP-IV的分離純化研究，大都需要使用多根色譜柱進(jìn)行，過程復(fù)雜。如以牛腎臟為原料，通過CM-cellulose、Sephadex G-200和3 次DEAE陰離子交換柱才純化得到DPP-IV。本研究通過1 次柱層析就可高度分離純化出牛腎DPP-IV，過程簡單，耗時短且純度較高。純化過程中，酸沉淀、熱處理和硫酸銨鹽析等步驟除去大部分雜蛋白，之后通過100 kDa的超濾濃縮膜進(jìn)一步除去小部分雜質(zhì)和低分子質(zhì)量蛋白，最后通過凝膠過濾層析純化得到DPP-IV。本研究從牛腎中分離純化DPP-IV的得率為9.5%，高于從牛腎臟（3.1%）和豬腎臟（8.3%）中純化的得率。

DPP-IV作為一種膜結(jié)合的糖蛋白，其胞外主要是由N端的一個8葉-螺旋結(jié)構(gòu)域和C端的一個/水解結(jié)構(gòu)域組成，螺旋槳結(jié)構(gòu)域與水解酶結(jié)構(gòu)域相重疊，催化三聯(lián)體（S630、H740和D708）位于這兩個結(jié)構(gòu)域的界面上。圓二色譜結(jié)果說明DPP-IV具有典型的-折疊構(gòu)象，當(dāng)溫度超過70 ℃時，-折疊占比減少，-螺旋占比增加，說明DPP-IV的-折疊構(gòu)象遭到破壞，二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。非還原條件下的SDS-PAGE結(jié)果顯示，DPP-IV是由2 個相同亞基組成的二聚體，與此前報道的膜結(jié)合的DPP-IV以同源二聚體的形式存在于細(xì)胞表面相對應(yīng)。二聚體結(jié)構(gòu)有利于DPP-IV的催化活性，而單體不具有催化活性。

2D-PAGE結(jié)果表明，DPP-IV等電點約為5.8，略高于Buckley等報道的牛血清樣DPP-IV（4.74）和Brownlees等報道的牛腎DPP-IV（4.25），與陳宏報道的豬腎DPP-IV（6.1）接近。在金屬離子對DPP-IV活力的影響中，Zn的影響最為強(qiáng)烈，這與報道Zn可作為DPP-IV的抑制劑一致。今后，有必要對Zn、Fe及Fe對DPP-IV活力及二級結(jié)構(gòu)的影響作進(jìn)一步細(xì)化研究。

4 結(jié) 論

以牛腎皮質(zhì)為原料，通過酸沉淀、硫酸銨鹽析和凝膠過濾層析純化得到高純度DPP-IV。DPP-IV是分子質(zhì)量為106 kDa的糖蛋白，等電點為5.8，易形成二聚體，具有典型的-折疊結(jié)構(gòu)。DPP-IV的熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性較好，Zn對它具有較強(qiáng)的抑制作用。本研究簡化了DPP-IV的純化步驟，提高了純化效率，為低成本制備DPP-IV并應(yīng)用于抑制肽篩選提供了參考。