新型分子印跡聚合物修飾的選擇性離子源結合電噴霧電離質譜快速檢測莠滅凈和莠去津

馬洪悅，楊敏莉，張 峰,*，楊丙成，章飛芳,*

（1.華東理工大學藥學院，制藥工程與過程化學教育部工程研究中心，上海 200237；2.中國檢驗檢疫科學研究院 國家市場監管重點實驗室（食品質量與安全），北京 100176）

莠滅凈和莠去津屬于三嗪類除草劑，化學結構式如表1所示，在農作物種植過程中應用較為廣泛。然而三嗪類除草劑具有高毒性，人體長期接觸可能會造成接觸性皮炎，如果其殘留通過食品、地表徑流和地下水的污染進入人體，會造成人體畸變或誘導致癌，因此開發出能夠有效檢測食品中三嗪類農藥殘留的方法具有重要意義。

表1 莠滅凈和莠去津的化學結構式Table 1 Chemical structures of ametryn and atrazine

目前，三嗪類除草劑等農藥殘留的檢測主要借助氣相色譜、液相色譜、氣相色譜-串聯質譜、高效液相色譜-串聯質譜等方法。但這些檢測方法均離不開樣品前處理步驟，才能將復雜基質中的痕量目標物有效提取，固相萃取是常用的前處理方法，例如Bichon等利用固相萃取與加壓液體萃取相結合，在凍干牡蠣中提取了5 種三嗪類農藥；Wang Shanshan等利用雙模板分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymer，MIP）在玉米、小麥和棉籽樣品中富集了17 種三嗪類農藥。但這些檢測方法在應用過程中都具有明顯的缺點，即需要較長時間的色譜分離和復雜的樣品前處理。同時，液相色譜主要是依靠色譜柱對不同物質之間的保留時間不同而達到分離目標物的效果，色譜柱正確選擇、流動相的比例調整、洗脫梯度的合理設置均對色譜分離至關重要，這些因素使氣相色譜、液相色譜、氣相色譜-串聯質譜、液相色譜-串聯質譜在快速檢測領域的應用具有一定的局限性。

近20年間，敞開式質譜技術因其不需要色譜分離的優勢而迅速發展，一定程度上彌補了氣相色譜和液相色譜技術的缺點，實現了僅需少量或無需前處理直接在原位檢測痕量目標物。敞開式質譜檢測技術的發展得益于敞開式離子源的開發，目前已報道的有40多種，例如，解吸電噴霧電離，直接實時分析，常壓固體分析探針，介質阻擋放電電離，紙噴霧電離，快速蒸發電離等。為了進一步提高敞開式質譜離子源的選擇性，有研究人員將一系列的納米吸附材料與敞開式離子源結合，實現了對目標物更快更精準的檢測。

本研究將分子印跡技術與敞開式質譜技術相結合，開發一種快速檢測食品中莠滅凈和莠去津的方法。以鐵片為固體基板，氰草津為虛擬模板，使用苯胺和甲基丙烯酸在水溶液中合成了集選擇性富集和快速檢測為一體的敞開式離子源，經過實驗驗證，該方法操作簡單、高效省時、靈敏度高，可實現對食品中μg/kg級莠滅凈和莠去津的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

莠滅凈（純度98.0%）、莠去津（純度99.1%）、氰草津（純度97.4%）、磺胺對甲氧嘧啶（純度99.3%）德國Dr. Ehrenstorfer. GmbH公司；甲基丙烯酸（純度99%） 美國Sigma-Aldrich公司；過硫酸銨（純度＞99%），乙腈、丙酮、甲醇、乙醇（均為分析純）賽默飛世爾科技（中國）有限公司；正硅酸四乙酯（以SiO計≥28.4%）、苯胺（純度98.0%）、氨水（25.0%～28.0%） 國藥集團化學試劑有限公司；3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷（3-(trimethoxysily)propyl methacrylate，MPS）（純度＞98.0%） 東京化成工業株式會社；苯胺（純度98.0%），甲酸、乙酸（純度＞99.7%） 上海安譜實驗科技股份有限公司；硫酸（98.08%） 韓國德山公司；實驗用水由Milli-Q超純水系統制備；鐵片購自北京市某五金店。

1.2 儀器與設備

QTRAP 5500質譜儀 美國AB Sciex公司；G560E渦旋振蕩器 美國Scientific Industries公司；DW-P103-1ACE0高壓電源 天津東文高壓電源有限公司；KQ-500DE超聲清洗機 昆山市超聲儀器有限公司；MFV-24氮吹儀 廣州得泰儀器科技有限公司；BV1010多管振蕩儀 美國Benchman公司；超純水機 美國Millipore公司；PHS-25型號pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分子印跡聚合物修飾鐵片（molecularly imprinted polymer modified iron sheet，MIPIS）及非分子印跡聚合物修飾鐵片（non molecularly imprinted polymer modified iron sheet，NIPIS）的制備

MIPIS的制備過程主要包括鐵片的表面改性及MIP涂覆兩個步驟。

1.3.1.1 鐵片的表面改性

鐵片表面改性處理參考文獻[24]的方法：包括表面酸處理和雙鍵化修飾2 個過程。對鐵片進行酸處理是為了有效去除鐵片表面的鍍鋅層，暴露出內部的四氧化三鐵，有利于后續對鐵片進行修飾。鐵片表面硅氧化修飾后，接枝雙鍵能夠為之后MIP的聚合過程提供反應位點。

首先，將厚度為0.3 mm的鐵片剪裁為1 cm×2 cm（底、高）的等腰三角形，以2 mol/L硫酸超聲處理鐵片約1 h，直至鐵片邊緣呈現微鋸齒形，超聲結束后，用超純水反復洗滌鐵片至表面呈中性，再以適量丙酮沖洗，用氮氣吹干。之后，將處理后的鐵片放入盛有4 mL超純水、50 mL乙醇的錐形瓶中，緩慢滴加5 mL濃氨水和2 mL正硅酸四乙酯，將其置于搖床上，以180 r/min室溫反應12 h，反應結束后分別使用超純水和乙醇沖洗并吹干，得到表面修飾硅氧鍵的IS@SiO。將所得的IS@SiO浸入60 mL甲醇溶液中，逐滴加入2 mL MPS，置于搖床上，以相同的速度室溫反應24 h，反應結束后用乙醇反復沖洗產物3～5 次，用氮氣吹干，最終得到表面修飾雙鍵的IS@SiO@MPS。

1.3.1.2 IS涂覆MIP

將30 mg氰草津和90 μL甲基丙烯酸溶于50 mL水中，放入1 片IS@SiO@MPS，置于搖床上，以180 r/min反應30 min。隨后加入100 mg苯胺、66 mg過硫酸銨和1 mL 1.0 mol/L HCl溶液，在常溫條件下以相同的速率反應24 h。合成的產物用超純水洗滌數次，用甲醇沖洗，并用氮氣吹干。以甲醇-乙酸（95∶5，/））為洗脫劑，在索氏抽提器中去除聚合物中的模板分子，得到MIPIS。NIPIS的制備除不加模板分子外，其他步驟與MIPIS的制備過程相同。

1.3.2 樣品制備

首先，稱取2 mg豆奶粉樣品，加入15 mL乙腈，渦旋振蕩1 min，超聲3 min，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，收集上清液，用氮氣吹至近干，用15 mL甲醇溶液復溶，所得溶液作為待測液。實驗中其他樣品的前處理流程與之相同。

1.3.3 MIPIS萃取樣品

取10 mL待測液于樣品瓶中，加入1 片MIPIS，置于搖床上，180 r/min振搖20 min。MIPIS取出晾干后利用銅夾將其固定在搭建好的3D移動平臺上，調整MIPIS角度，使其尖端距離質譜進樣口約1 cm。在MIPIS表面滴加10 μL 0.2% 氨水-甲醇溶液，接入3.3 kV的高壓電源后，直接進行質譜檢測。

1.3.4 質譜檢測

質譜檢測采用正離子條件下的多反應監測模式，使用Analyst軟件對莠滅凈和莠去津定量離子產生的峰面積進行定量，相關質譜參數見表2。

表2 莠滅凈和莠去津的母離子、子離子、去簇電壓和碰撞能Table 2 Parent ions, product ions, de-clustering potential and collision energy for ametryn and atrazine

1.3.5 方法學考察

實驗分別配制了質量濃度范圍為0.2～200 μg/L的基質待測溶液和溶劑待測溶液，利用MIPIS對其進行富集并檢測，并繪制基質標準曲線和溶劑標準曲線用于判定方法的基質效應。基質效應是影響外標法準確定量的重要因素，按下式計算基質效應（）：

式中：和分別為基質標準曲線和溶劑標準曲線的斜率。

2 結果與分析

2.1 掃描電鏡表征

材料的表面形貌一般可通過掃描電鏡進行表征。為了觀察MIPIS和NIPIS的表面形貌，對各個反應階段的產物進行了掃描電鏡表征。如圖1所示，原始鐵片（圖1A）表面較為光滑，經過酸化反應以及硅氧化修飾后，得到圖1B，可以看出鍍鋅層基本都被腐蝕，鐵片表面呈現凹凸不平的形態，且表面接枝較多的球狀基團，為后續的MIP的修飾提供了反應位點。由圖1C、D可以看出，材料表面呈現蜂窩狀，有較多的孔穴，為吸附待測物提供了條件。

圖1 掃描電鏡表征Fig. 1 SEM images

2.2 提取條件和質譜條件優化

不同提取條件會對目標物的提取效果產生影響，本研究在加標量為50 μg/kg的豆奶粉樣品混合溶液中對提取溶劑，提取時間以及提取液pH值進行優化，結果如圖2所示。

選擇合適的提取溶劑是萃取過程的關鍵因素，實驗選取丙酮、乙酸乙酯和乙腈3 種常用的提取溶劑對樣品中的莠去津和莠滅凈進行提取，并對MIPIS富集的目標物進行檢測。由圖2A可知，相比于丙酮和乙酸乙酯，乙腈作為提取溶劑時MIPIS富集到的目標物更多，檢測得到的峰面積更高，所以乙腈對莠滅凈和莠去津的提取效果更好。由于莠滅凈和莠去津屬于中等極性的農藥，而乙酸乙酯更適合提取一些極性較大的物質，因此乙酸乙酯對莠滅凈和莠去津的提取能力稍弱。同時，乙腈具有沉淀蛋白質的作用，有利于降低樣品中的基質干擾，從而提高提取效率；并且乙腈具有極易揮發的特性，這更有利于提取液的吹干和復溶過程。因此，實驗選擇乙腈作為提取溶劑。

MIPIS對目標物的富集是一個動態過程，因此實驗分別對提取時間為5、10、20、25 min和30 min條件下MIPIS富集的目標物含量進行了考察，如圖2B所示，莠滅凈的定量離子形成的峰面積在前20 min呈現不斷增加的趨勢，在20 min達到最大值，在20～30 min內，樣品基質內的大分子對于吸附位點的干擾，造成峰面積值有輕微下降，基本達到動態平衡。莠去津在提取時間為25 min時測得的峰面積值最大，但僅比提取時間為20 min時所測得的峰面積高2.7%。因為提取實驗是在2 種目標物的混合溶液中進行，為了統一提取時間，實驗選擇20 min作為MIPIS對目標物的提取時間。

提取溶液pH值是影響目標物與MIPIS有效結合的重要因素，因為在不同pH值條件下，目標物會呈現不同的離子狀態，影響其與MIPIS上的吸附位點的氫鍵形成。實驗分別對提取液pH值為3、5、7、9、10條件下的MIPIS對莠滅凈和莠去津的富集量進行了檢測，結果如圖2C所示。在pH值為7的條件下，MIPIS對莠滅凈和莠去津的富集效果最佳，在pH值為3或10的條件下，MIPIS對莠滅凈和莠去津的富集效果較差，這可能是由于莠滅凈和莠去津在強酸或強堿的條件下不穩定，會發生分解反應。根據莠滅凈和莠去津的結構，氨基的氫原子和三嗪環的氮原子會作為結合位點，構建所需的關鍵相互作用，而甲基丙烯酸中的羧基既是氫鍵受體又是供體，因此莠滅凈和莠去津分別會與甲基丙烯酸形成雙氫鍵。在pH值較低時，由于甲基丙烯酸中的酸性基團和目標物處于質子化形式，這可能使得目標物分子或甲基丙烯酸中的氫鍵位點直接與水合氫離子相互作用，而不是目標物與MIPIS之間有相互作用。在較高的pH值下，更多的目標物和甲基丙烯酸的酸性基團也呈現離子形式，減少了氫鍵形成能力。因此，較高或較低的pH值都會導致MIPIS對莠滅凈和莠去津的提取效率降低。因此pH值為7被選為提取溶液的最佳pH值。

實驗分別對噴霧電壓和噴霧溶劑2 個參數進行優化。如圖2D所示，分別檢測噴霧電壓為2.8、3.0、3.3、3.5、3.8 kV和4.0 kV條件下莠滅凈和莠去津的定量離子的信號強度。當噴霧電壓小于2.8 kV時，由于噴霧溶劑的表面張力較大，不能形成有效噴霧，所以檢測不到目標物的信號；當噴霧電壓大于2.8 kV時，信號強度隨著噴霧電壓的增加而不斷增加，在噴霧電壓達到3.3 kV時，信號強度達到了最大值。而當噴霧電壓大于3.3 kV時，信號強度逐漸下降，這是由于噴霧電壓過高時，包裹目標物的噴霧溶劑聚集在MIPIS尖端形成大液滴，被快速擊散成小液滴噴落在質譜進樣口周圍，只有少量小液滴形成有效的噴霧進入質譜進樣口，造成目標物的信號強度較低。因此，選擇3.3 kV作為噴霧電壓。

如圖2E所示，分別考察甲醇、0.2%甲酸-甲醇和0.2%氨水-甲醇作為噴霧溶劑，對MIPIS上莠滅凈和莠去津的洗脫能力。根據各定量離子的峰面積可知，噴霧溶劑為含0.2%氨水-甲醇所洗脫出的莠滅凈和莠去津的量最多，其值是噴霧溶劑為甲醇時解吸量的1.19 倍和1.13 倍，是噴霧溶劑為0.2%甲酸-甲醇的1.45 倍和1.39 倍。這是由于堿性條件下，氫鍵更容易發生斷裂，使目標物與MIPIS上的選擇性位點更易分離，從而洗脫出更多的目標物。因此選擇0.2%氨水-甲醇作為實驗的噴霧溶劑。

圖2 不同條件下提取莠滅凈和莠去津的優化結果Fig. 2 Optimization of the extraction conditions for ametryn and atrazine

2.3 MIPIS材料評價

2.3.1 特異性評價

實驗選擇磺胺對甲氧嘧啶作為競爭性目標物，通過比較MIPIS和NIPIS對莠滅凈、莠去津和磺胺對甲氧嘧啶的吸附能力來評價MIPIS的特異性。在含量為50 μg/kg的加標豆奶粉樣品待測液中將一片MIPIS和一片NIPIS分別置于上述溶液中，按1.3.3節平行測定3 次。MIPIS和NIPIS對莠滅凈、莠去津和磺胺對甲氧嘧啶的吸附結果如圖3所示。結果表明，MIPIS吸附的莠滅凈和莠去津對應峰面積是NIPIS的1.6 倍和2.6 倍，這是由于MIPIS具有特異性吸附位點，對目標物吸附容量大，而NIPIS受到樣品中其他大分子物質的干擾，因此對目標物的吸附量會降低。圖中還可以看出MIPIS和NIPIS由于對磺胺對甲氧嘧啶沒有特異性的吸附孔穴，吸附量較小。

圖3 MIPIS和NIPIS對莠滅凈、莠去津和磺胺對甲氧嘧啶的提取量的比較Fig. 3 Comparison of efficiencies of MIPIS and NIPIS for extraction of ametryn, atrazine and sulfameter

2.3.2 富集效率評價

富集因子是評價固體基板材料富集效率的重要指標，富集因子定義為MIPIS和空白鐵片對樣品基質中同一濃度目標物的萃取量的比值。在空白豆奶粉樣品的待測液中加入莠滅凈和莠去津的混合標準溶液，配成50 μg/kg的混合溶液，分別加入一片MIPIS和一片空白鐵片，按照1.3.3節平行測定3 次。結果顯示MIPIS對莠滅凈和莠去津的富集因子分別為22.24±2.30、28.14±3.75，莠滅凈的富集因子值稍低于莠去津。從化學結構上看，是由于莠滅凈的三嗪環上的取代基團位阻更大，因此在與莠去津競爭MIPIS上的特異性吸附位點時，顯示出更弱的競爭力，因此，莠去津的富集值更高一些。

2.4 MIPIS結合電噴霧電離質譜方法學評價

2.4.1 基質效應的考察

基質效應有基質抑制和基質促進作用，其評價標準為：當基質效應大于20%時，表現為明顯的基質增強效應；當基質效應小于－20%時，表現為明顯的抑制作用；當基質效應在－20%～20%之間時，則基質效應不明顯。當基質效應明顯時，需要采用基質標準曲線準確定量從而消除基質效應。通過計算，莠滅凈和莠去津的基質效應分別為－23.9%和－8.7%，結果說明樣品基質對莠滅凈具有基質抑制作用，莠去津的基質效應不明顯，即對莠滅凈來說，MIPIS對豆奶粉樣品中的基質干擾抵抗能力較弱。因此，為了獲得更準確的定量結果，采用莠滅凈和莠去津的基質標準曲線作為定量標準。

2.4.2 標準曲線、LOD與LOQ結果

表3 莠滅凈和莠去津在甲醇和豆奶粉中的線性關系、LODs、LOQs、日內精密度和日間精密度Table 3 Linear relationships, LODs, LOQs, intraday and interday precision for the determination of ametryn and atrazine in methanol and soy milk powder

在豆奶粉待測液和甲醇中加入莠滅凈和莠去津的混合標準溶液，配制成質量濃度為0.2～200 μg/L的基質標準溶液和溶劑標準溶液，并用MIPIS進行提取，按照1.3.3節方法進行檢測，所得標準曲線結果如表3所示。莠滅凈和莠去津在0.2～200 μg/L質量濃度范圍內線性良好（＞0.998 2）。另外，還測定莠滅凈和莠去津檢出限（limits of detection，LOD）和定量限（limits of quantification，LOQ），結果如表3所示，LOD范圍在0.2～0.5 μg/kg之間，LOQ在0.6～1.5 μg/kg之間，說明MIPIS結合電噴霧電離質譜方法可實現豆奶粉中痕量莠滅凈和莠去津殘留的靈敏檢測。

2.4.3 重復性和再現性結果

通過測定日內精密度和日間精密度用以評價重復性和再現性。通過在1 d內對豆奶粉加標樣品連續分析6 次并測定3 d，評價MIPIS結合電噴霧電離質譜方法的重復性和再現性。在空白豆奶粉樣品待測液中加入的莠滅凈和莠去津混合標準品配制成含量為50 μg/kg的混合溶液，并測定莠滅凈和莠去津的RSD。如表3所示，結果表明日內精密度為12.10%和10.63%，日間精密度為8.79%和13.04%，表明MIPIS結合電噴霧電離質譜方法對豆奶粉中莠滅凈和莠去津的檢測具有良好的重復性和重現性。

2.5 材料重復使用性考察

以吸附-洗脫為一個循環，考察MIPIS的重復使用性。在空白豆奶粉的待測液中加入莠滅凈和莠去津的混合標準溶液，配成50 μg/kg的混合溶液，加入一片MIPIS，按照1.3.3節進行檢測，計算其回收率。之后用甲醇-乙酸（95∶5，/）浸泡清洗MIPIS，再進行下一次吸附-洗脫，循環了5 次。結果如圖4所示，隨著使用次數的增加，MIPIS的回收率逐漸下降，這可能是由于每一次的洗脫都會對MIPIS上的吸附位點造成一定量的破壞，并且吸附位點會在有機溶劑中發生溶脹使得有效的吸附位點減少。在這5 次吸附-洗脫循環中，莠滅凈和莠去津的回收率分別在79.90%～95.06%之間和82.43%～106.45%之間，證明MIPIS至少可重復使用5 次。

圖4 5 個吸附-洗脫循環期間莠滅凈和莠去津的回收率Fig. 4 Recoveries of ametryn and atrazine during five adsorption-elution cycles

2.6 實際樣品測定及準確度考察

最后，利用所開發的MIPIS結合電噴霧電離質譜方法對購于北京當地超市的豆奶粉，小麥和牛奶樣品中的莠滅凈和莠去津進行檢測，測定結果表明，在這些樣品中未檢測到莠滅凈和莠去津，或是樣品中莠滅凈和莠去津的含量低于本方法的定量限。之后，在這些樣品中加入混合標準溶液配制成10、50μg/kg和100 μg/kg 3 種不同含量的莠滅凈和莠去津的混合樣品溶液，利用所開發的MIPIS-ESI-MS方法檢測莠滅凈和莠去津并計算了每類樣品中的2 種除草劑的回收率。如表4所示，莠滅凈和莠去津的回收率在81.05%～109.66%范圍內，RSD在4.03%～15.89%之間，說明準確度良好。

表4 實際樣品中莠滅凈和莠去津的含量以及不同添加水平的回收率結果Table 4 Contents and recoveries of ametryn and atrazine in real samples with different spiked levels

3 結 論

以氰草津為虛擬模板，利用甲基丙烯酸和苯胺在鐵片上合成了一種選擇性離子源，結合電噴霧電離質譜，建立了一種快速檢測食品基質中痕量莠滅凈和莠去津的方法，對豆奶粉，小麥，牛奶三類樣品分別以10、50、100 μg/kg 3 個含量進行加標回收實驗，平均回收率在81.05%～109.66%之間，RSD為4.03%～15.89%，能夠為三嗪類農藥殘留的快速檢測提供一定的參考。