基于MP-KG凝膠體系研究微觀結構影響質構特性的調控機制

袁華根，施 帥，奚照壽，潘雪峰，陳 霞，陳銀基,*

（1.江蘇農牧科技職業學院，江蘇 泰州 225300；2.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇 南京 210023；3.南京市高淳區農業農村局，江蘇 南京 211300）

利用膳食纖維替代脂肪開發健康低脂香腸是當前加工肉制品行業的研究熱點。從營養角度，膳食纖維被譽為“第七大營養素”，能夠改善腸道益生菌群和降低心血管疾病的發生幾率。世界衛生組織建議膳食纖維每日攝入量應該達到25 g。然而相關實驗結果顯示：不同類型的膳食纖維作為脂肪替代物對低脂香腸的感官質構影響差異顯著，例如：抗性淀粉和卡拉膠等既能夠降低低脂香腸蒸煮損失，而且改善質構特性（硬度和咀嚼性）；微晶纖維素等能夠顯著降低低脂香腸蒸煮損失，但是對質構影響差異不顯著；羧甲基纖維素和黃原膠等對低脂香腸質構甚至有負面作用。此外，研究者還發現膳食纖維在香腸中的運用存在添加量極限。例如：卡拉膠改善火雞香腸感官質構的添加量極限為0.8%；甘蔗不溶膳食纖維改善豬肉低脂香腸感官質構的添加量極限為2.0%。目前，膳食纖維影響蛋白凝膠類產品的質構特性的作用機制還鮮有文章報道。

魔芋膠提取于魔芋草本植物的根部，其主要成分是魔芋葡甘聚糖。魔芋葡甘聚糖是一種非離子型水溶性高分子多糖，由-葡萄糖和-甘露糖聚合而成。魔芋膠作為一種膳食纖維，具有零卡路里、螯合膽固醇和促進腸道蠕動功能作用。因此，本實驗以肌原纖維蛋白-魔芋膠（myofibrillar protein-konjac glucomannan，MP-KG）為模擬體系，通過微觀結構（石蠟切片和掃描電鏡）、圖像分析軟件技術（分維分析和缺項分析）和質構特性，進而闡釋微觀結構對蛋白凝膠質構的調控機制，為KG在低脂肉制品中的應用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬后腿肉購于蘇果超市；KG 上海北聯生物科技有限公司；過氧化氫、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、乙二醇-雙-2-氨基乙醚四乙酸（ethylene glycol bis (2-aminoethyl ether) tetraacetic acid，EGTA）、碳酸一氫鈉、碳酸二氫鈉、氯化鎂、戊二醛 西格瑪試劑有限公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

MM-12絞肉機 中國豐偉機械有限公司；切片機德國徠卡公司；T25DS25I KA均質機、磁力攪拌器德國IKA公司；Avanti JXN-30離心機 美國Beckman公司；TW20水浴鍋 德國Julabo公司；TA-XT Plus質構儀英國Stable Micro Systems公司；PQ001低場核磁共振儀蘇州紐邁公司；S-3000N掃描電鏡 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 MP的提取和復合體系的制備

剔除豬后腿肉中結締組織和脂肪并絞肉機絞碎（0.6 mm孔板），用雙層真空包裝袋（聚乙烯）進行分裝，每袋500 g，貯存于－20 ℃。提取前取出豬后腿肉并放置于0～4 ℃冷庫中解凍至中心溫度為0 ℃。

MP提取方法參照Han Minyi等，并稍作改動。具體操作步驟如下：將50 g斬拌后的肉糜和4 倍體積的磷酸緩沖溶液（10 mmol/L NaHPO/NaHPO、0.1 mmol/L NaCl、2 mmol/L MgCl、1 mmol/L EGTA、pH 7.0，4 ℃）混合均質（6 000×，30 s）。將均質后混合溶液用雙層紗布進行過濾后離心（3 000×，15 min）取沉淀，重復上述過程兩遍，最終沉淀物即為純MP。雙縮脲方法測定純MP濃度。將甘蔗膳食纖維進行超微粉碎，過100 目篩的標記為100 目，剩余通過50 目的標記為50 目。將甘蔗不溶性膳食纖維添加到MP中，并將蛋白質量濃度稀釋至50 mg/mL（0.6 mol/L NaCl，pH 7.0）。不同粒徑（50、100 目）甘蔗膳食纖維添加量為3 個梯度：1.0%、2.0%和3.0%。用攪拌器攪拌混合體系3 min，以確保甘蔗膳食纖維均勻分布。將部分樣品進行蒸煮（80 ℃、20 min）并冷卻至室溫4 ℃，另一部分樣品用于流變測定。

1.3.2 水分分布

參照Bertram等方法，并稍作改動。將樣品加入直徑為1 cm的石英玻璃管中并避免氣泡的產生，進而水?。?0 ℃）加熱凝膠并冷卻至室溫。使用PQ001低場核磁共振儀對樣品進行測定，質子共振頻率為22.3 MHz，樣品測試溫度為32 ℃，采用的測試算法為CPMG序列（carrpurcell-meiboom-gill sequence）。測試具體參數如下：90°脈沖和180°脈沖時間間隔為250 μs；回波次數12 000。利用3 組分算法分析并生成弛豫時間圖；3 個不同水分組分的弛豫初始時間、峰值時間和結束時間以及3 個不同水分組分對應的峰面積和占比比例。為方便描述，弛豫圖每個組分的峰值時間作為弛豫時間，以表示，而每個組分峰面積所占總積分面積的百分比，以表示。

1.3.3 復合凝膠的形變特性

參照Czerner等方法并稍作改動。使用質構儀測定樣品（直徑2 cm、高度2 cm）的復合凝膠斷裂時的形變特性，具體參數如下：下降速率2.0 mm/s、測試速率1.0 mm/s，質構探頭為P50型號，壓縮比90%。其中的復合凝膠斷裂形變時的應變計算公式如下：

式中：為樣品初始高度；為樣品發生斷裂形變時的壓縮高度。

復合凝膠斷裂形變時的應力計算按照下式計算：

式中：為壓縮過程中所測得的力；為樣品接觸探頭的表面積。

1.3.4 石蠟切片

將凝膠樣品切割成1 cm×1 cm×2 cm的長方體，并用4%的多聚甲醛進行結構固定。將樣品從固定液取出后，進行切片和染色后，用正置明場顯微鏡放大1 000 倍觀察切片的微觀結構。每個樣品取5 個不同的觀察視野。

1.3.5 掃描電鏡和圖像處理

掃描電鏡及其圖像處理的方法參照Han Minyi等，并稍作改動。將凝膠樣品切割成側面1 cm的長方體，并用2.5%的戊二醛磷酸緩沖溶液進行結構固定。固定后用磷酸緩沖溶液對樣品進行多次漂洗后，用不同體積分數乙醇溶液對樣品脫水。脫水干燥后的樣品粘于金屬臺上進行噴金鍍膜。最后將樣品置于S-3000N掃描電鏡中進行放大2 000 倍觀察。每個樣品分別觀察5 個視野。將掃描電鏡圖像導入ImageJ v1.47后，利用其Fraclac 2.5 v插件對其進行處理分析。首先，在圖像的像素調整到640×432后，對其進行二維化處理。分維分析反映不規則復雜結構占有空間的有效性。盒計數法為在圖像上定義幾個尺寸縮小的網格，并計算每個網格中包含蛋白三維網絡結構的像素數量。分維維度按下式計算：

式中：為凝膠蛋白三維網絡結構的分維維度；N為不同尺寸網格中所包含的像素數量；為網格的尺寸。

缺項分析是反映凝膠三維網絡結構中水孔隙的均勻程度。缺項分析定義為在圖像中定義個數量相同大小的網格，計算這些網格中代表水相形成水孔隙的目標像素的變異系數。缺項分析基于下式計算：

式中：為目標像素的缺項；為所有大小網格內目標像素數量的標準差；為所有大小網格內目標像素數量的平均值。

1.4 數據分析

本實驗設計采用完全隨機區組的方法，所有處理重復3 次。所有的數據用SAS 9.0統計軟件進行分析，添加KG處理組采用方差分析，比較方法采用Duncan多重比較分析，＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 MP-KG凝膠的形變特性

通過質構儀測定MP-KG凝膠破碎瞬間的參數，并利用公式計算得到復合凝膠斷裂形變時應力應變。如圖1所示，KG添加量對復合凝膠斷裂形變時應力應變影響顯著。隨著KG添加量提高，復合凝膠的斷裂形變時應力變化呈現拋物線形，這說明KG對復合凝膠的應力改善具有添加量極限。復合凝膠斷裂形變時應變的變化趨勢和應力相似，但是兩者的添加量極限不同。圖1顯示添加1%的KG組斷裂形變時的應力最大為13.73 kPa，添加0.5%的KG組斷裂形變時的應變最大為1.02。當KG添加量達到2%時，復合凝膠的斷裂形變時的應力應變最低，分別為16.31 kPa和0.68。這說明當KG超過添加量極限后會顯著降低復合凝膠的質構特性，甚至要低于對照組。

圖1 KG添加量對復合凝膠斷裂形變時應力應變的影響Fig. 1 Effect of KG concentration on fracture stress and fracture strain of composite gels

2.2 低場核磁共振

在MP凝膠體系中水分子存在3 種分布狀態：1）結合水，能和MP分子緊密結合在一起，弛豫時間（）分布在1～10 ms；2）不易流動水，被束縛于MP凝膠網絡結構的間隙中，弛豫時間（）分布在200～400 ms；3）自由水，其不被凝膠網絡結構所束縛并自由流動，弛豫時間（）分布在1 000～2 000 ms。在肌原纖維凝膠體系中，水分子的分布狀態能夠直接反映MP凝膠結構體系，尤其是不易流動水，其弛豫時間越短說明肌原纖維凝膠網絡結構越致密，是因為凝膠結構對水分子的束縛能力越強。因此，測定不易流動水的弛豫時間能夠直接反映KG對MP交聯程度的影響。如表1所示，添加不同比例KG對復合凝膠中3 種分布狀態的水分子弛豫時間和相對百分比。結果顯示：隨著KG添加量的增加，不易流動水的弛豫時間呈現勾狀變化趨勢，在添加1.0%時不易流動水的弛豫時間最低且其相對百分比最高，分別為274 ms和92.79%。這說明KG能夠有效的促進形成致密的蛋白凝膠網絡結構提高對水分子的束縛。當添加量增加到2%時，處理組的弛豫時間最高且相對百分比最低，分別為343.51 ms和77.51%。這說明當KG超過添加量極限后會抑制MP凝膠網絡結構的聚集。此外，KG添加量的變化對結合水的影響不顯著，說明結合水的變化只與MP比例相關。KG添加量顯著影響自由水的百分比，在添加1.0% KG時自由水的百分比最低，這說明凝膠網絡結構能夠束縛足夠多的不易流動水，進而降低了自由水的比例。

表1 KG對MP凝膠中水分弛豫時間和百分比的影響Table 1 Effect of KG concentration on relaxation times and percentage peak areas of water in composite gels

2.3 相限行為

如圖2所示，石蠟切片能夠清晰顯示不同添加量的KG在肌原纖維凝膠網絡結構中的相限行為，其中紅色部分是MP，白色部分是水相，灰色陰影部分是KG。對照組顯示MP凝膠微觀結構，其為多孔的不規則的三維網絡結構。未添加KG時，對照組的MP三維網絡結構均勻，三維網絡結構間隙中均勻的分布著形狀大小各異的白色水空穴。當添加少量KG時，KG以分散相的形式被包裹在MP凝膠網絡體系中。KG的形狀大小顯著大于對照組中的水空穴，因此復合凝膠的微觀結構不再均勻。當KG添加量超過1%時，KG不再鑲嵌在MP網絡結構中。KG自身可以通過氫鍵作用發生水合形成弱凝膠結構，進而與MP凝膠結構相互滲透交叉，形成雙連續相。本實驗顯示KG在MP凝膠網絡體系中的相限行為隨著添加量而變化：KG添加量低于1%時，碳水化合物以分散相的形式被包裹在MP凝膠網絡體系中；KG添加量高于1%時，碳水化合物和MP均形成連續相，且兩者相互滲透交叉。

圖2 不同添加量的KG在蛋白凝膠中的空間分布Fig. 2 Spatial distribution of konjac glucomannan at various concentrations in composite gels

2.4 掃描電鏡結果

如圖3所示，掃描電鏡能夠清晰顯示不同添加量的KG對肌原纖維蛋熱誘導交聯程度的影響，其中白色部分為MP骨架結構。觀察結果顯示添加不同比例KG對MP三維凝膠網絡結構影響顯著。觀察對照組發現MP凝膠網絡結構呈粗絲狀甚至部分區域呈現團狀結構，說明在加熱過程中MP折疊結構并沒有充分展開，大量疏水基團依然包埋在分子內部，進而在后續加熱過程中沒有大量疏水基團進行彼此交聯形成致密的三維網絡結構。此外，在MP三維網絡結構間隙中存在大量黑色空穴，這些黑色空穴相互交聯進而形成水溝壑，將MP三維網絡凝膠結構分割成片狀化。

當KG添加量小于1.0%時，觀察處理組掃描電鏡發現MP凝膠網絡結構呈細絲狀且交聯致密，沒有粗絲和團狀蛋白存在。和對照組相比MP三維網絡結構間隙中黑色空穴數量和大小顯著降低。這說明在常溫下KG通過氫鍵與水合作用將水分子束縛在KG分子結構中，降低了水溝壑的形成以及其對MP三維網絡凝膠結構的分割。但是當KG添加量超過1.0%時，觀察處理組掃描電鏡發現MP的三維網絡凝膠結構沒有細絲的出現，整個結構呈現粗絲狀且相當疏松。此外，和對照組相比MP三維網絡結構間隙中黑色溝壑數量和大小顯著增加，并與MP網絡結構相互交叉貫穿。這說明添加高濃度的KG時，KG會和MP溶液中的水分形成連續的水凝膠，KG水凝膠和MP兩者互不相溶并形成相互穿插，這使得MP被分割成碎片化。

圖3 不同添加量的KG對MP微觀結構的影響Fig. 3 Effect of KG concentration on scanning electron micrographs of composite gels

為進一步客觀比較KG添加量對MP網絡結構的影響，本實驗使用圖像處理軟件對MP網絡結構（白色部分）進行分維分析和溝壑（黑色部分）進行缺項分析（圖4）。分維分析結構的數值大小和MP網絡結構致密度呈正比；缺項分析與溝壑大小和形狀的差異性呈正比。分析結果顯示處理組（添加1% KG）MP凝膠網絡結構的分維維度1.872顯著高于其他KG組（＜0.05），而缺項值0.279顯著小于其他添加KG組（＜0.05）。處理組（添加2% KG）MP凝膠網絡結構的分維維度1.789顯著低于其他KG組（＜0.05），而缺項值0.345顯著高于其他添加KG組（＜0.05）。

圖4 KG添加量對MP凝膠網絡結構分維維度和缺項值的影響Fig. 4 Effect of KG concentration on fractal dimension and lacunary of composite gels

2.5 MP-KG凝膠體系微觀結構對感官質構特性的調控

實驗證明KG作為優質的脂肪替代物的可行性，并進一步研究MP-KG微觀結構對復合凝膠質構特性的調控機制。從微觀角度分析，石蠟切片顯示KG和MP屬于熱力不相溶體系，隨著KG添加量提高，兩者的相行為結構呈現填充結構到互穿結構的轉變。當復合凝膠呈現為互穿結構時，KG通過氫鍵和水合作用形成的水凝膠為弱凝膠，其凝膠強度顯著小于MP凝膠強度；KG形成的水凝膠會嚴重阻礙MP疏水基團的暴露以及后續加熱過程中的交聯。因此，在互穿體系中MP不能進行充分交聯，以及KG水凝膠本身是弱凝膠，進而導致最終復合凝膠質構劣變。當復合凝膠呈現為填充結構時，MP為連續相KG為填充相，通過掃描電鏡顯示填充結構中的MP凝膠網絡結構更加致密且水空穴顯著降低。由于溶液狀態的MP過熱過程中變性展開后滲出大量水分，形成相互交錯的水溝壑并導致MP三維網絡結構分割成片狀化。添加KG后，KG的水合能力降低水溝壑的形成，進而形成致密整體化的三維網絡凝膠結構。

從復合凝膠質構角度，當添加KG（＜1%）能夠顯著提高復合凝膠斷裂形變時的應力和應變，降低不易流動水的弛豫時間，這顯示添加少量KG能夠顯著改善復合凝膠質構。當添加KG（＞1%）時，復合凝膠斷裂形變時的應力和應變顯著降低，不易流動水的弛豫時間顯著提高降低，這顯示KG添加量超過1%會導致復合凝膠質構的劣變。

圖5 MP-KG凝膠體系中微觀結構對感官質構的調控機制Fig. 5 Regulatory mechanism of the microstructure of MP-KG composite gels on their textural properties

如圖5所示，KG的水相穩定能力能夠減少MP中水溝壑的形成，促進致密的整體化MP凝膠網絡結構的形成，進而提高復合凝膠斷裂形變時應力和應變。MP-KG的相行為為互穿結構時，KG通過氫鍵和水合作用形成的水凝膠為弱凝膠，其凝膠強度顯著小于MP凝膠強度；KG形成的水凝膠會嚴重阻礙MP疏水基團的暴露以及后續加熱過程中的交聯，進而使得復合凝膠質構劣變（即斷裂形變時的應力和應變顯著降低）。

3 結 論

KG顯著影響MP凝膠的質構品質，當添加量小于0.5%時復合凝膠的斷裂形變時的應力應變顯著提高；當添加量大于1%時復合凝膠的斷裂形變時的應力應變顯著降低。從石蠟切片和掃描電鏡顯示，當KG添加量小于1%時，KG均勻分散在蛋白基質中呈填充結構，其穩定水相減少熱誘導凝膠過程中蛋白網絡結構內部水溝壑的形成，間接促進MP之間的交聯，形成致密均一的網絡結構并改善復合凝膠的質構特性；當KG添加量大于1%，KG通過水合作用形成的連續弱凝膠，與MP形成互穿結構，進而嚴重阻礙MP在后續加熱過程中的交聯，進而使得復合凝膠質構劣變。