基于網絡藥理學研究板藍根抑菌活性成分及其作用機制

田 薇，李秀梅，楊 娟，王小瑩，周煒煒，李中媛，戴小楓

(1. 中國農業科學院飼料研究所，農業農村部飼料生物技術重點實驗室，北京 100081；2. 天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

細菌感染會對禽畜養殖行業造成巨大的經濟損失，目前，普遍采取抗生素作為抑菌劑進行防治，由于長期使用抗生素，會產生耐藥菌株，導致抗生素不斷加大使用量，造成“超級細菌”的產生，嚴重威脅到公共衛生安全和養殖業的健康發展。中藥防治禽畜疾病具有悠久的歷史，而且中藥具有無殘留或低殘留、低毒副作用、不易形成耐藥性等優勢，因此，從中草藥中尋找到一種能夠替代抗生素作為抑菌劑的方法具有重要意義。

板藍根()是中國著名的傳統中藥，又名菘藍、北板藍、大藍根及大青根等，其為十字花科植物菘藍的干燥根，入藥前需要炮制，被作為藥材記錄在《神農本草經》中已有上千年歷史，其性寒，味先甘后苦，具有清熱解毒、涼血利咽之功效，在臨床中應用廣泛。現代藥理研究證實，其主要對常見的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌、枯草桿菌等多種強感染性的病原微生物具有不同程度的抑制效果。板藍根抑菌藥效成分復雜、作用靶點多，但目前的研究中缺乏對板藍根抑菌作用的整體認識。

近年來，隨著網絡藥理學的不斷發展，越來越多的研究人員將網絡藥理學和中醫藥研究聯系起來，從傳統的尋找單一靶點轉變為從系統層次和生物網絡的整體角度研究，分析具有多成分、多途徑和多靶點協同作用等特點的中藥中大多數成分的變化，更重要的是確定中藥作用靶標，并對中藥的分子機制進行分析，闡述了多靶點與多成分間復雜網狀相互作用關系。所以，本研究通過網絡藥理學揭示板藍根抑菌的藥效成分及其作用分子機制，從而為板藍根抑菌作用的深入研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 數據庫平臺

網絡藥理學研究所用網絡數據庫平臺網址見表1。

表1 本文所用數據庫及網址

1.2 材料

1.2.1 菌株 大腸桿菌CVCC1515來源于本課題組。

1.2.2 藥品和試劑 豆甾醇(純度≥98%)、LB培養基、5×蛋白上樣緩沖液購自北京索萊寶科技有限公司,SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒購自美國BIO-RAD公司,未預染蛋白Marker購自Thermofisher Scientific公司。

1.2.3 儀器 MultiskanTM Skyhigh酶標儀(Thermofisher Scientific公司),SDS-PAGE蛋白電泳儀(BIO-RAD公司),凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司),低溫高速離心機(Tokyo公司),落地式超凈工作臺(Airtech公司)。

1.3 方法

1.3.1 板藍根藥效成分-靶點網絡圖的構建 通過數據庫TCMSP搜索板藍根的化學成分和潛在作用靶點，篩選口服生物利用度(OB)≥30%和化合物類藥性(DL)≥0.18的藥效成分，將靶點導入Uniprot數據庫進行標準化處理。利用Cytoscape_3.7.0軟件構建板藍根藥效成分-潛在作用靶點網絡圖。

1.3.2 抑菌靶點搜集 以“抑菌(antibacterial)”作為檢索關鍵詞，利用GeneCards和OMIM數據庫搜索相關靶點，獲取并篩選抑菌靶點。

1.3.3 抑菌靶點篩選 通過Venny 2.1軟件繪制韋恩圖，對板藍根抑菌靶點進行可視化處理，并利用Cytoscape_3.7.0軟件構建“藥物-成分-疾病-靶點”的可視化網絡圖。

1.3.4 蛋白互作網絡的構建 將板藍根藥效成分的抑菌靶點導入STRING數據庫中，選擇“human”物種，進行PPI預測分析，構建關鍵靶點互作網絡。

1.3.5 GO功能和KEGG通路富集分析 將所有板藍根抑菌關鍵靶點輸入至DAVID在線分析數據庫，以≤0.01為前提進行GO分析和KEGG通路分析，根據GO富集分析前10條繪制富集數量統計柱狀圖，選取KEGG富集分析前20條信號通路繪制富集顯著性氣泡圖。

1.3.6 分子對接 選取抑菌關鍵靶點并在PBD數據庫中查找對應分辨率較高的蛋白,并下載3D結構式。從Pubchem數據庫中下載相應藥效成分3D結構。通過Autodock Tools 1.5.7軟件對蛋白質進行除去水分子和加氫等操作，將處理后的關鍵靶點和藥效成分結構導入Autodock Tools 1.5.7軟件中進行分子對接驗證試驗，結合能越小代表對接越穩定，若結合能<0 kJ·mol，表示蛋白質與小分子能夠自發地結合；結合能≤-20.93 kJ·mol，則表示結合活性良好，選取結合能≤-20.93 kJ·mol的蛋白質-小分子對接，通過PyMol 2.4軟件構建3D示意圖。

從式(2)可以看出，如果在t-tr時刻發射了電磁波，那么會在t時刻接收到反射回來的回波信號。由于vr遠小于c,故延時tr可以近似如式(5)所示：

1.3.7 抑菌試驗 設置空白對照組和藥物處理組(1.00、0.5.00、0.25 mg·mL)，大腸桿菌終濃度1×10CFU·mL，37 ℃共培養12 h，取菌液稀釋至10個·mL，取100 μL稀釋菌液涂布于LB平板培養基，37 ℃培養24 h，記錄菌落數。

抑菌率=(空白對照菌落數—試驗組菌落數)/空白對照菌落數×100%。

1.3.8 SDS-PAGE法檢測目的蛋白含量 設置空白對照組和豆甾醇處理組(1.00、0.50、0.25 mg·mL)，大腸桿菌終濃度1×10CFU·mL，37 ℃、200 r·min條件下共培養12 h，每組各取3 mL菌液，5 000 r·min離心10 min，用無菌PBS重懸菌液至相同濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min，12 000 r·min離心1 min，取上清進行SDS-PAGE電泳。

2 結 果

2.1 板藍根藥效成分—靶點網絡圖的構建

運用TCMSP在線數據庫篩選得到33個符合條件的藥效成分，包括黃酮類、甾體類化合物、吲哚類化合物、生物堿等(表2)。通過Cytoscape_3.7.0軟件對板藍根33個藥效成分和61個藥效成分作用靶點進行映射(圖1)，化學成分的degree值越高，說明該化學成分作用靶點越多，為關鍵成分，發現-谷甾醇(27)、豆甾醇(23)、金合歡素(19)、清風藤堿(15)、甜橙黃酮(15)等可能為抑菌關鍵藥效成分。

表2 板藍根主要活性成分

綠色三角代表板藍根，黃色菱形代表板藍根的藥效成分，藍色橢圓形代表板藍根潛在作用靶點The green triangle represents Isatis indigotica, the yellow diamond represents the effective active ingredients of Isatis indigotica, and the blue oval represents the potential target of Isatis indigotica圖1 板藍根藥效成分-靶點網絡圖Fig.1 Active ingredients - target network of Isatis indigotica

2.2 板藍根藥物-成分-疾病-靶點網絡圖的構建

通過GeneCards和OMIM在線數據庫獲得2 192個 靶點。板藍根靶點與抑菌靶點取交集后得到32個交集靶點(圖2)。利用Cytoscape_3.7.0軟件構建“藥物-成分-疾病-靶點”的可視化網絡圖(圖3)，作用靶點越多的藥效成分，其在生理生化作用中越關鍵。

圖2 板藍根與抑菌交集靶點韋恩圖Fig.2 Venn diagram of intersection targets of Isatis indigotica and antibacterial

紅色的V形代表抑菌，綠色三角形代表板藍根，黃色菱形代表板藍根藥效成分，藍色橢圓代表交集靶點The red V shape represents bacteriostasis, the green triangle represents Isatis indigotica, the yellow diamond represents the effective active ingredients of Isatis indigotica, and the blue ellipse represents the intersection target圖3 “藥物-成分-疾病-靶點”網絡圖Fig.3 “Drugs-Ingredients-Diseases-Targets” network diagram

2.3 板藍根抑菌的關鍵靶點蛋白互作網絡的構建

把32個交集靶點輸入STRING數據庫進行PPI分析，其中，一個靶點上的連線越多，則這一靶點蛋白等級越高。靶點之間的連線越多，可以說明靶點蛋白之間的結合度越高，除去游離靶點CHRM3和KCNH2后，剩余30個靶點進行PPI分析(表3)。

表3 板藍根抑菌STRING網絡關鍵靶點

2.4 GO功能富集分析和KEGG通路分析

通過DAVID在線分析數據庫對板藍根關鍵抑菌靶點進行GO功能富集分析，共獲取126條GO條目，分別選取前10個分析條目繪制柱狀圖(圖4)。生物過程主要涉及對雌二醇的反應、凋亡信號通路、神經元凋亡過程的正調控、沒有配體的外源性凋亡信號通路、對有毒物質的反應等86個；細胞組分主要分布于細胞質、核、膜筏、核質、線粒體等11個；分子功能主要體現在蛋白質同源二聚化活性、酶結合、蛋白結合、泛素蛋白連接酶結合、參與細胞凋亡過程的半胱氨酸型內肽酶活性等29個。KEGG通路分析共獲得TNF信號通路、NOD受體信號通路、TOLL樣受體信號通路等59個通路，選取KEGG富集顯著性統計前20條通路繪制氣泡圖(圖5)。

圖4 板藍根抑菌靶點的GO分析Fig.4 GO analysis of antibacterial targets of Isatis indigotica

圖5 板藍根抑菌關鍵靶點 KEGG 通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis of key antibacterial targets of Isatis indigotica

2.5 分子對接

“藥物-成分-疾病-靶點”網絡圖中選取degree值排名前3的核心藥效成分與抑菌關鍵靶點CASP3、PTGS2編碼的蛋白分子進行對接(表4)，所有組合對接結合能均<0 kJ·mol，表明蛋白質與小分子能夠自發結合。其中,結合能≤-20.93 kJ·mol的蛋白質-小分子對接結果3D示意圖見圖6。

表4 板藍根核心藥效成分與抑菌關鍵靶點的結合能

圖6 PTGS2和CASP3與板藍根核心藥效成分分子對接3D圖(結合能≤-20.93 kJ·mol-1)Fig.6 Molecular docking 3D diagram of PTGS2 and CASP3 with core active ingredients in Isatis indigotica(binding energy≤-20.93 kJ·mol-1)

2.6 抑菌試驗

通過分子對接預測篩選出核心藥效成分，采用菌落計數法驗證-谷甾醇、豆甾醇、金合歡素對大腸桿菌的抑菌作用，因-谷甾醇和金合歡素的溶解性差，易析出，未能獲得試驗數據。通過菌落計數法證明豆甾醇對大腸桿菌的抑菌作用呈劑量依賴關系(圖7)。

A. 抑菌試驗；B.抑菌率A. Bacteriostatic test; B. Antibacterial rate圖7 豆甾醇對大腸桿菌的抑制作用Fig.7 Antibacterial effect of stigmasterol on Escherichia coli

2.7 SDS-PAGE法檢測目的蛋白含量

采用SDS-PAGE法驗證豆甾醇對目的蛋白PTGS2(74 ku)和CASP3(17 ku)表達的影響。結果表明，豆甾醇處理組與對照組相比，豆甾醇能夠下調大腸桿菌胞內PTGS2和CASP3蛋白的表達量，且呈劑量依賴關系(圖8)，可見，豆甾醇處理組的大腸桿菌胞內的CASP3和PTGS2可能被分泌到了胞外，說明豆甾醇通過調控CASP3和PTGS2關鍵靶點實現抑菌作用，與分子對接的預測結果一致。

M.Marker；1.空白對照組；2～4.豆甾醇高、中、低劑量組M. Marker; 1. The blank control; 2, 3, 4. Stigmasterol with high, medium and low dose圖8 豆甾醇對大腸桿菌菌體蛋白表達量的影響Fig.8 Effect of stigmasterol on protein expression of Escherichia coli

3 討 論

板藍根是清熱解毒的代表藥物，具有抗菌、抗病毒、增強機體免疫力等功效。現代藥理學研究證明，板藍根具有廣譜的抑菌活性，發現其對雞白痢沙門菌、肺炎雙球菌等革蘭陰性菌有較強的抑菌能力。但其具體抗菌作用成分和作用機制尚未知。

本研究通過網絡藥理學思路篩選了33個藥效成分。金合歡素、異牡荊素、高車前素、甜橙黃酮、花旗松素、新橙皮苷等是黃酮類化合物，對許多病原微生物(革蘭陰性菌和革蘭陽性菌、真菌)具有不同程度抑制效果；其中，金合歡素可抑制金黃色葡萄球菌中膜相關蛋白SrtA的活性，結果能夠影響該細菌的蛋白 A (SpA) 與細胞壁的組裝，并減少金黃色葡萄球菌的結合，從而達到抑菌的效果；有研究發現，高車前素具有抑制黃曲菌、紅色毛蘚菌等真菌的能力。扶桑甾醇、谷甾醇、-谷甾醇、膽固醇、豆甾醇等甾體類化合物，具有抗菌作用；其中，-谷甾醇能夠增加抗菌肽的表達、與細胞結合位點結合等方法達到抑菌效果。-谷甾醇能一定程度抑制金黃色葡萄球菌、芽胞桿菌等。依靛藍酮、羥基靛玉紅等吲哚類化合物，對革蘭陰性菌、革蘭陽性菌、真菌和植物病菌均具有一定抑制能力。基于此，推測板藍根可以通過這33種藥效成分及其相應的抑菌靶點起到抑菌作用。

PPI蛋白互作網絡分析結果表明，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、腫瘤蛋白P53(tumor protein P53，TP53)、胱天蛋白酶3(apoptosis-related cysteine peptidase，CASP3)、轉錄因子AP-1(transcription factor AP-1,JUN)、人前列腺素內過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)等互作頻率較大，為板藍根抑菌關鍵靶點。其中,TNF是板藍根抑菌最關鍵的靶點，TNF可通過激活T細胞免疫活性參與免疫應答，具有殺傷轉化細胞和某些病毒感染的細胞的能力。在接受TNF-α受體阻滯劑的風濕性關節炎患者中出現嚴重甚至具有致命性的軍團菌和李斯特菌感染的風險。TP53是影響細胞生長、遷移和損傷修復的關鍵感應因子，其與先天性抗病毒免疫、抗增殖作用及病毒的復制與轉錄都有關。CASP3為caspase級聯激活下游重要成分，是執行細胞凋亡的核心蛋白，在細胞凋亡早期階段，CASP3被激活時，由兩個大亞基(17 ku)和兩個小亞基組成。PTGS2為前列腺素生物合成中的核心成分，能夠參與細胞凋亡、氧化應激等多種生理病理過程，其既是一種過氧化物酶也是一種雙環氧合酶，能夠將二十二碳五烯酸酯轉化為13R-HDPA，13R-HDPA經過加工修飾能夠激活巨噬細胞吞噬作用在細菌感染期間。由此推測，板藍根可能通過這些抑菌靶點發揮抑菌作用。

GO和KEGG富集分析結果表明，板藍根抑菌涉及多方面生物學過程和多條信號通路，根據值得到TNF信號通路、NOD受體信號通路、TOLL樣受體信號通路等主要信號通路。TNF是一種多功能的促炎信號因子，其與細胞膜上特異性受體結合，參與免疫調節細胞的激活、功能和分化，具有調控防止惡性細菌感染、免疫系統、細胞凋亡等作用。TOLL樣受體為免疫系統里的關鍵蛋白，特異性識別病原微生物上的受體，激活一系列先天性免疫應答，進而調控炎癥因子、趨化因子的表達，細胞因子也通過調控各種炎癥和抑菌基因，包括趨化因子、免疫細胞的募集和激活，達到消滅金黃色葡萄球菌的目的。NOD受體信號通路是一種關鍵的先天免疫系統，其屬于模式識別受體的特定家族，能夠識別多種病原微生物并激活先天性免疫反應，其中，NOD1、2能夠檢測從內體區室中逸出的細菌肽聚糖片段的胞質存在，從而調控NF-κB和MAPK的激活、細胞因子的產生和細胞凋亡。推測板藍根主要通過這些通路起到抑菌作用。分子對接結果表明，板藍根核心藥效成分與關鍵靶點均能夠自發結合，其中,大部分組合擁有良好的結合活性(結合能≤-20.93 kJ·mol)，表明了板藍根藥效成分能夠通過調控上述抑菌關鍵靶點起到抑菌作用，本研究通過SDS-PAGE法發現，與對照組相比，豆甾醇藥物處理組大腸桿菌(CVCC1515)胞內PTGS2和CASP3的蛋白表達量隨著藥物濃度的升高而下降，表明豆甾醇藥物處理組大腸桿菌(CVCC1515)胞內PTGS2和CASP3的蛋白被分泌到胞外，胞外的PTGS2和CASP3的蛋白表達量隨藥物濃度的增加而增大，該結果與車蕾的研究結果相同，在車蕾的研究中，用高氧液處理細菌生長，通過實時定量PCR發現試驗組中CASP3和SOD基因顯著升高，說明高氧液的作用是通過氧抑制作用，使細菌程序性死亡增加實現的。綜上所述，板藍根具有一定的抑菌作用，驗證了上述網絡藥理學預測結果的可靠性。

4 結 論

板藍根主要通過豆甾醇調控CASP3、PTGS2等靶點，基因功能富集于細胞凋亡、轉錄調控等參與癌癥途徑、TNF信號通路發揮抑菌作用。