奶牛乳腺炎模型的建立及炎癥相關因子基因mRNA轉錄水平的分析

羅仍卓么，王晉鵬，焦 鵬，李彥霞，董益聞，魏大為，王興平*

(1.寧夏大學農學院，銀川 750021； 2.寧夏回族自治區反芻動物分子細胞育種重點實驗室，銀川 750021)

奶牛乳腺炎是一種由細菌等病原體引起的乳腺疾病，可導致奶牛產奶量下降、獸醫護理費用增加和死淘率上升，從而影響奶牛場的經濟效益。金黃色葡萄球菌()和大腸桿菌()是引起乳腺炎的主要致病菌，其中，為革蘭陰性菌，其感染經常會引起急性、癥狀嚴重的臨床乳腺炎，甚至會引起奶牛死亡；而是引起乳腺炎的最常見的革蘭陽性菌，可在乳腺吞噬細胞中存活，逃避乳腺免疫系統的殺傷，因此感染奶牛乳腺組織后很難被機體清除，也極易產生耐藥性，常常會引起難以治愈的亞臨床隱性乳腺炎。上述兩種細菌具有不同的病原體相關分子模式，引起的奶牛乳腺炎具有不完全相同的臨床癥狀。因此，和也分別作為引起臨床和亞臨床乳腺炎的主要病原體，用于乳腺炎活體模型的制備。在基因表達方面，感染奶牛可立即激活促炎因子基因的表達，而感染的反應較為緩慢，其引起炎癥因子基因的表達程度較低。但是，乳腺炎相關的差異表達基因有很多，在型和型乳腺炎中，仍有很多基因的表達情況尚不清楚，有待于進一步探討。

作者前期通過乳腺炎奶牛乳腺組織的轉錄組測序分析，初步獲得了趨化因子家族的C-C基序趨化因子配體2(C-C motif chemokine ligand 2，2)、C-C基序趨化因子配體8(C-C motif chemokine ligand 8，8)、C-X-C基序趨化因子受體1(C-X-C motif chemokine receptor 1，1)、C-X-C基序趨化因子2(C-X-C motif chemokine 2，2)、C-X-C基序趨化因子13(C-X-C motif chemokine 13，13)、補體因子Ⅰ(complement factor I，Ⅰ)、補體因子B(complement factor B，)、自噬調節因子孕酮誘導的蛻膜蛋白1(decidual protein induced by progesterone 1，1)和白細胞介素21受體(interleukin 21 receptor，21)共9個候選基因，但是它們在型和型乳腺炎奶牛的乳腺組織中的mRNA轉錄水平尚不完全清楚。因此，本研究建立了型和型奶牛乳腺炎活體模型，檢測了上述9個基因在對照組和誘導組奶牛乳腺組織中的mRNA轉錄水平，以期為深入研究不同類型乳腺炎的分子調控機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

(ATCC 25923)和(ATCC 25922)凍干粉購自上海復祥生物科技有限公司；逆轉錄試劑盒(貨號RR047A)、熒光定量試劑盒TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (貨號RR820A)和TriZol試劑均購自TaKaRa寶日醫生物技術(北京)有限公司；TLR4抗體(sc-29372)、TNFα抗體(sc-133192)、NF-κB p50抗體(sc-8414)和羊抗兔IgG-HRP(sc-2030)均購自圣克魯斯生物技術(上海)有限公司；Synergy LX多功能酶標儀購自BioTek(美國)；CFX 96 Touch熒光定量PCR儀均購自Bio-Rad公司(美國)。

1.2 試驗動物

購于同一飼養條件、處于泌乳盛期的2～3歲 頭胎荷斯坦奶牛。所有奶牛泌乳周期相同，體況健康，牛奶體細胞數(somatic cell count，SCC)<20萬·mL。 隨機分為對照組、誘導組和誘導組，每組各3頭。

1.3 奶牛乳腺炎活體模型的建立

為消除由于奶牛可能有其他炎癥性疾病而引起的試驗誤差，給奶牛注射抗生素7 d進行平衡處理。然后繼續飼養21 d以消除抗生素殘留，使奶牛達到體況良好，無炎癥且牛奶SCC<20萬·mL。

將和凍干粉溶解、劃線接種、挑取單菌落和擴大培養，用PBS稀釋至10CFU·mL的接種密度。清潔奶牛乳房和乳頭，75%乙醇消毒，用通乳針將5 mL 1×10CFU·mL的和懸浮液經乳導管分別一次性注入到試驗組奶牛乳房的右后乳區內，對照組奶牛注射等量的無菌PBS。在接種后的第7天，采用無菌手術法活體采集奶牛的乳腺組織，用于乳腺炎病理鑒定和組織RNA提取。

1.4 乳腺炎奶牛模型的鑒定

1.4.1 臨床診斷和組織病理檢測 奶牛乳腺感染細菌后，測定奶牛體溫和牛奶SCC，并診斷奶牛感染后的臨床癥狀。此外，將采集到的乳腺組織經過石蠟包埋、組織切片、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色和顯微拍照，觀察對照組、誘導組和誘導組奶牛乳腺組織的病理變化。

1.4.2 乳腺組織免疫相關蛋白質的檢測 Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)/ 核因子激活的B細胞的κ-輕鏈增強子(nuclear factor kappa light chain enhancer of activated B cells，NF-κB)信號通路在動物固有免疫和炎癥反應中具有重要的作用。為了驗證奶牛乳腺炎模型的構建結果，本試驗采用組織免疫熒光技術檢測了對照組、誘導組和誘導組奶牛乳腺組織中TLR4/NF-κB信號通路關鍵分子TLR4、NF-κB和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNFα)的表達水平，采用Image J軟件進行表達量統計，-檢驗進行差異表達顯著性檢驗。

1.5 RNA提取與qPCR

1.5.1 RNA提取與cDNA合成 采用TRIzoL法提取對照組、誘導組和誘導組奶牛乳腺組織的總RNA，利用多功能酶標儀檢測RNA的純度(OD/OD≥1.8；OD/OD≥1.0)和濃度(總RNA濃度≥800 ng·μL)。按照逆轉錄試劑盒說明書，以經檢測合格的1 000 ng RNA為模板，進行逆轉錄PCR，獲得cDNA。

1.5.2 qPCR引物 根據GenBank公布的基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計qPCR引物(表1)。引物由通用生物系統(安徽)有限公司合成，無菌超純水溶解。

表1 qPCR引物信息

1.5.3 qPCR反應 分別以對照組、誘導組和誘導組奶牛乳腺組織的cDNA為模板，利用qPCR試劑盒進行相關基因mRNA轉錄水平的檢測。qPCR反應體系為2×TB Green Premix ExⅡ 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA模板100 ng，加無菌無酶的ddHO至20 μL。 qPCR反應程序：95 ℃預變性30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環；95 ℃ 10 s，65 ℃ 5 s。每個檢測進行3次重復。

1.5.4 統計分析 以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，)和前折疊蛋白樣伴侶(ubiquitously expressed prefoldin like chaperone transcript，)作為內參，采用2-△△方法計算基因的相對表達量。利用GraphPad Prism 8.0軟件，通過單因素方差分析法進行組間基因表達量的差異顯著性檢驗，<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 奶牛乳腺炎模型的建立

2.1.1 乳腺炎臨床檢查 用和分別感染奶牛乳房，在感染1 d后，兩個感染組奶牛體溫明顯升高，在第4、5天達到40 ℃左右，并表現出典型的乳腺炎臨床癥狀：乳頭發紅、腫脹、疼痛、發熱和牛奶產生絮狀沉淀。其中，組在第4、5天時奶樣絮狀嚴重，乳汁變清水樣，第7天乳房出現結塊。組反應較激烈，在第3天時奶樣出現豆渣樣，第4天乳清變黃色，第5天乳房出現結塊，第6天牛開始出現下痢，糞便呈灰綠色。第3天以后，兩組牛的奶樣體細胞數大于90萬·mL， 且產奶量顯著下降，到第6～7天出現停乳。上述診斷結果顯示，奶牛已產生嚴重的乳腺炎。

2.1.2 乳腺組織病理鑒定 乳腺組織HE病理觀察結果表明，與對照組相比，誘導組和誘導組奶牛的乳腺小葉結構破壞，乳腺腺泡受損，腺泡腔減小，部分乳腺上皮細胞的形態發生變化，并出現中性粒細胞和巨噬細胞等炎性細胞浸潤(圖1)。

A. 對照組；B. S. aureus誘導組；C. E. coli誘導組A. Control group; B. S. aureus-induced group; C. E. coli-induced group圖1 乳腺組織的HE染色(100×)Fig.1 HE staining of mammary gland tissue (100×)

2.1.3 TLR4/NF-κB信號通路關鍵分子的表達量檢測 TLR4、NF-κB和TNF-α是TLR4/NF-κB固有免疫和炎癥信號通路的關鍵分子。為驗證奶牛乳腺炎模型的可靠性，采用組織免疫熒光技術檢測了它們在對照組、誘導組和誘導組中的表達情況，結果表明，與對照組相比，誘導組和誘導組奶牛乳腺組織的TLR4、NF-κB和TNF-α蛋白質的表達水平均極顯著上調(<0.01)(圖2)，說明了和可使奶牛乳腺組織啟動TLR4/NF-κB固有免疫信號通路，并產生了炎癥反應。上述結果從蛋白質水平上說明了本試驗所建立的乳腺炎模型是可靠的。

A. TLR4免疫熒光；B. NF-κB免疫熒光；C. TNF-α免疫熒光。**.P<0.01A. TLR4 immunofluorescence; B. NF-κB immunofluorescence; C. TNF-α immunofluorescence. **. P<0.01圖2 奶牛乳腺組織TLR4、NF-κB和TNF-α蛋白的免疫熒光檢測(40×)Fig.2 Expression of TLR4, NF-κB and TNF-α in bovine mammary tissues by immunofluorescence (40×)

2.2 qPCR檢測結果

為探討奶牛感染和后炎癥相關基因的mRNA轉錄水平，采用qPCR技術檢測對照組、誘導組和誘導組的趨化因子家族2、8、1、2和13，補體因子和，以及自噬調節因子1和白介素受體21共9個基因的mRNA 轉錄水平。

2.2.1 趨化因子基因mRNA轉錄水平的檢測結果 qPCR檢測結果顯示，與對照組相比，誘導組和誘導組的趨化因子2、8、1和2基因的mRNA轉錄水平均極顯著上調(<0.001)；2、8和1在誘導組的mRNA轉錄水平極顯著高于誘導組(<0.001)；13僅在誘導組中的mRNA轉錄水平極顯著上調(<0.001)，在誘導組中的上升趨勢不顯著(>0.05)(圖3)。結果說明，在和感染奶牛乳腺后，上述基因可能在組織炎癥反應中具有重要的作用。

**.P<0.001圖3 奶牛乳腺組織趨化因子基因mRNA轉錄水平的檢測結果Fig.3 Detection results of mRNA transcription levels of chemokine genes in dairy cow mammary tissues

2.2.2 補體因子基因mRNA轉錄水平的檢測結果 qPCR檢測結果表明，與對照組相比，誘導組和誘導組中補體因子和基因mRNA轉錄水平極顯著上調(<0.001)，尤其是在誘導組和誘導組的mRNA轉錄水平分別上調51倍和42倍。此外，在誘導組的mRNA轉錄水平極顯著高于誘導組(<0.001)，而在誘導組的mRNA轉錄水平極顯著低于誘導組(<0.001)(圖4)，推測這兩個基因在和誘導的乳腺炎中可能具有不同的調控方式。

**. P<0.001圖4 奶牛乳腺組織 CFI和CFB基因mRNA轉錄水平的檢測結果Fig.4 Detection results of mRNA transcription levels of CFI and CFB genes in dairy cow mammary tissues

2.2.3 自噬調節因子1和白細胞介素受體21基因mRNA轉錄水平的檢測結果 qPCR檢測結果表明，與對照組相比，誘導組和誘導組中自噬調節因子1基因mRNA轉錄水平均極顯著下降(<0.001)(圖5)，說明在炎癥發生中細胞維持內環境穩態遭到嚴重破壞。21基因在誘導組和誘導組mRNA轉錄水平均極顯著上升(<0.001)，且誘導組mRNA轉錄水平極顯著高于誘導組(<0.01)(圖5)。鑒于21基因具有重要的免疫抑制作用，表明在和感染后，奶牛免疫力急劇下降，并且感染后對免疫力的影響作用更明顯。

*. P<0.01; **. P<0.001圖5 奶牛乳腺組織DEPP1和IL21R基因mRNA轉錄水平的檢測結果Fig.5 Detection results of mRNA transcription levels of DEPP1 and IL21R genes in dairy cow mammary tissues

3 討 論

奶牛乳腺炎受多基因組成的分子網絡共同調控，其發生與發展機制非常復雜。為進一步解析乳腺炎的分子調控機制，近年來，人們利用奶牛乳腺上皮細胞(bovine mammary epithelial cells，bMECs)炎癥模型和奶牛乳腺炎活體誘導模型開展分子水平上的研究。在這兩種模型中，奶牛乳腺炎活體誘導模型接近于臨床乳腺炎，是更合理的研究材料。迄今為止，幾乎全部研究均采用高濃度菌液短時(24 h)感染奶牛乳房，誘導產生奶牛急性乳腺炎。但是，上述模型所檢測基因的表達量差異很大，甚至出現表達趨勢不一致的結果，可見基因表達水平與乳腺炎癥程度、奶牛個體遺傳、病原菌的類型和劑量、以及感染時間等多種因素有關。和是引起奶牛乳腺炎的常見病原菌。乳腺炎是奶牛養殖過程中被病原體長期感染的過程。因此，為了更接近乳腺炎自然發生與發展的過程，作者分別將較低濃度的和長時間(7 d)感染奶牛乳房，成功建立了型和型乳腺炎模型，并進行了趨化因子基因、補體因子、細胞因子受體和自噬調節因子共9個基因mRNA轉錄水平的檢測分析，以期為奶牛乳腺炎的分子機制研究提供參考。

本研究發現，和分別感染奶牛乳房后，乳腺組織內趨化因子家族的2、8、1、2和13基因的mRNA轉錄水平在s誘導組和誘導組均上升，說明2種病原菌感染可使乳腺產生固有免疫反應，有助于白細胞募集。在細胞水平上，人們發現bMECs對和s具有不同的免疫反應。脂多糖(LPS)是的主要致毒因子，能刺激Toll樣受體2(toll-like receptor 2，TLR2)和TLR4蛋白而啟動NF-κB和Fas信號通路，而s的致毒因子LTA能刺激TLR2，啟動AP-1和IL-17A信號通路。研究表明，、2、-6和-8、6、-1在LPS誘導的bMECs中的mRNA轉錄水平顯著高于LTA誘導的bMECs。Zhang等研究發現LPS和LTA誘導炎性bMECs可觸發基質成纖維細胞不同的免疫反應。本研究發現，誘導組趨化因子家族的2、8和1基因的mRNA轉錄水平比誘導組顯著升高，與上述細胞水平的研究結果一致。趨化因子蛋白超家族的表達量升高，可介導白細胞和其他效應細胞向炎癥損傷部位的遷移和黏附，從而引起組織炎癥。同時，上述結果解釋了通常引起急性臨床乳腺炎，而引起慢性乳腺炎的原因。

補體系統在免疫反應中的作用具有兩面性：它可通過對免疫系統的調節以及對炎癥細胞的直接殺傷作用，促進免疫監視并抑制炎癥的發展；但是，過度激活的補體可激活免疫抑制微環境，促進炎癥的快速發展。CFB為C3激活劑前體，主要由肝和巨噬細胞合成，是補體旁路活化途徑的關鍵因子，與唐氏綜合征、惡性腫瘤、系統性紅斑狼瘡等多種疾病有關。CFI是補體激活途徑中的一種重要抑制因子，與年齡相關性黃斑變性、急性出血性白質腦炎等疾病相關。在本研究中，相比于對照組，補體因子和基因在誘導組和誘導組奶牛乳腺中mRNA轉錄水平均極顯著上升，特別基因的上調倍數分別達到51倍和42倍，這種異常激活則可能對奶牛機體免疫產生抑制作用，從而促進了乳腺炎的發展。

細胞自噬是真核生物維持內環境穩態的一種保護性機制，即通過依賴溶酶體降解細胞質內破損的細胞器、致病性微生物和錯誤折疊的蛋白質，從而維持真核細胞內環境穩態。在正常生理情況下，自噬不影響細胞的生存和正常功能；而當機體內細胞自噬平衡被破壞時，自噬不足或過度均可引起細胞功能異常，導致相關組織細胞病理損害加重甚至死亡。自噬調節因子DEPP1是一個參與自噬激活的主要缺氧誘導因子，其N端含有一個過氧化物酶體靶向信號類型2(peroxisomal targeting signal type 2，PTS2)序列，該序列可與過氧化物酶體生物發生因子7(peroxisomal biogenesis factor 7，PEX7)受體結合并進入過氧化物酶體，調節過氧化氫酶的活性，從而調節細胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)的解毒能力，對叉頭框蛋白O3(forkhead box protein O3，FOXO3)誘導的自噬起關鍵調節作用。在本研究中，和感染乳腺造成奶牛的應激增加，導致1基因的mRNA 轉錄水平顯著降低，說明在和所致的乳腺炎發生過程中，減弱了細胞自噬，從而促進了組織炎癥過程。

21是機體免疫調節的基因之一。21結合-21后可激活MAPK、PI3K/AKT和JAKs-STATs等多種信號通路，調節不同基因的表達，進而調節T細胞、B細胞、自然殺傷細胞和樹突狀細胞的活化和增殖，從而參與機體的固有免疫和適應性免疫。作為新型的免疫調節因子，-21在艾滋病、胰腺導管腺癌和風濕性關節炎等多種自身免疫性疾病的發生發展中扮演著重要的角色。在本研究中，21基因的mRNA轉錄水平在誘導組和誘導組中顯著上升，提示在2種奶牛乳腺炎中，乳腺組織21基因表達上調可激活更多T細胞和B細胞等免疫細胞，參與乳腺固有免疫和適應性免疫的調節，以應對乳腺炎的發生與發展過程。

4 結 論

S.和感染奶牛乳房后，可造成嚴重的臨床型乳腺炎癥狀；兩種病原菌可上調乳腺組織中趨化因子2、8、1、2和13基因，補體因子和基因，以及白細胞介素受體21基因的mRNA轉錄水平，同時下調自噬調節因子1基因的mRNA轉錄水平，從而應對奶牛乳腺炎癥過程。此外，誘導組乳腺組織中的2、8、1、和21基因的mRNA轉錄水平均顯著高于組，解釋了是引起急性乳腺炎，而是引起慢性乳腺炎的原因。上述結果可為深入研究奶牛乳腺炎的分子調節機制提供參考，其深入的機制有待于進一步研究。