雞毒支原體MG-HY株感染雞氣管的轉錄組學分析

吳春琳，鐘樂苗，趙 妍，李文跡，黃曉紫，吳異健,2,3*

(1.福建農林大學動物科學學院, 福州 350002; 2.中西獸醫結合與動物保健福建省高等學校重點實驗室, 福州 350002; 3. 福建省獸醫中藥與動物保健重點實驗室, 福州 350002; 4.中科國創(南平)生物科技股份有限公司，南平 354200)

雞毒支原體(，MG)是一種大小介于細菌和病毒之間的微生物，富含黏附蛋白，能頑固地黏附在呼吸道或泌尿道上皮細胞。能夠引發雞、火雞及其他禽類的嚴重慢性呼吸道疾病(CRD)。典型癥狀表現為咳嗽、流漿液性鼻液、濕性啰音。MG自報道以來廣泛分布于世界上所有的養禽國家，每年給各養殖戶帶來嚴重的經濟損失。據統計，雞群在遭受MG感染之后弱雛增長率在10%左右；蛋雞的產蛋量下降20%左右；肉雞減重近40%。國內外學者對MG感染的研究超過了60年，但MG感染仍然是現代集約化養禽業的防控重點。

目前，疫苗仍是預防雞毒支原體感染的主要方法，特別是在種雞預防方面。然而，疫苗對MG感染不能完全保護，這可能是由于對MG與宿主相互作用以及宿主在感染后的免疫反應等方面認識有限。以往的研究證實了MG的致病作用與其在代謝過程中產生的神經氨酸酶、過氧化氫酶、卵磷脂酶、溶菌酶或溶血素有關；也與出現在早期定植過程中的Gapa、CrmA和Pvpa等黏附蛋白存在高度相關性。此外，體外雞胚氣管環研究檢測發現，幾種趨化因子和炎性細胞因子的表達釋放，包括IL-18、IL-1β、TNF-α、IFN-γ、CCL20等，與黏膜炎癥性病變存在高度相關性。盡管人們對MG與宿主之間的互作有所了解，但MG感染引起雞氣管黏膜炎性病變和黏膜免疫反應機制仍有待探索。

轉錄組測序已被應用于提供對分子機制的新見解，并探索宿主與病原體之間的相互作用。因此，本研究首先利用MG-HY株菌液建立SPF雛雞感染模型。隨后，使用RNA-seq分析探索了感染組和對照組氣管的全面基因表達譜。將表達量不同的基因(DEG)進行功能注釋和分類，為雞氣管黏膜免疫相關基因的鑒定提供參考。最后，為了進一步證實轉錄組分析的結果，作者使用qRT-PCR驗證了一些免疫相關基因表達，包括黏附分子(ALCAM、CD34、NECTIN1、CDH3)、炎性細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL18、IL1R1)和趨化因子(CCL4、CXCL8、CXCL13、CXCL14、CCL20)。該數據為進一步研究MG與宿主之間的相互作用提供基礎，并對臨床上MG感染的防治具有重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 毒株和實驗動物

SPF雞胚購自濟南斯帕法斯家禽有限公司，SPF雛雞由實驗室自行孵化飼養。MG-HY株(TOC-ID為10·0.2 mL)，由本實驗室分離鑒定保存。

1.2 動物感染和樣本采集

將60只1日齡的健康SPF雛雞隨機分為兩組(=30)，按照標準的育雛方法隔離飼養，兩組飼養管理條件一致。在20日齡時，感染組和對照組雛雞通過點眼滴鼻方式各接種0.2 mL·羽的MG-HY菌液和滅菌生理鹽水，每日觀察各組雞只的臨床癥狀，并對發病時間和臨床癥狀特征進行詳細記錄。于接種后3、5、7和15 d，每次隨機抽取6只雛雞進行心臟采血處死后剖檢，先觀察氣囊病變，根據Zhang等的研究方法，評估氣囊病變。后迅速采集氣管組織。將部分氣管組織用4%多聚甲醛固定，進行組織病理學分析。剩余的氣管樣品放置-80 ℃ 保存備用。

1.3 通過qRT-PCR定量氣管中的MG負荷

為了測定侵入氣管內的細菌載量，在感染后3、5、7和15 d(分別記作3、5、7和15 dpi)無菌取雛雞氣管(每組=6)，使用PBS沖洗后稱取100組織在無菌條件下勻漿。按參考文獻[11]建立的雞毒支原體qRT-PCR檢測方法，使用Roche Light Cycler儀器(Roche，上海)通過qRT-PCR檢測雛雞氣管中MG的DNA含量。

1.4 基因文庫構建與測序

將氣管組織保存在干冰中送Sangon Biotech有限公司進行測序分析，采用Total RNA Extractor(Trizol)提取試劑盒提取樣品的Total RNA，經Qubit 2.0熒光計和Qubit2.0RNA試劑盒(Thermo，上海)評估合格后，使用Sangon Biotech(上海)的Illumina測序平臺(Hiseq X Ten)上對cDNA文庫進行測序。

1.5 RNA-Seq數據分析

Hiseq X Ten系統生成的原始序列數據首先運用Fast-QC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)做質量評估，去除 3′端測序接頭序列和低質量(質量低于 20 個堿基)的堿基。干凈讀數以FASTQ格式存儲并用于定量分析。然后采用Map Splice軟件將過濾后序列與NCBI數據庫參考基因組進行比對，通過使用Picard工具(http://picard.sourceforge.net/)確定映射到每個基因的讀數總數來推斷每個基因的轉錄水平。運用DESeq軟件進行差異表達的基因篩選，以logFC>1或<-1且FDR<0.05為閾值篩選差異表達基因，合并兩組間的差異表達基因，通過基于MA繪圖分析得到表達強度值。

1.6 差異表達基因的功能注釋

對DESeq軟件鑒定的log倍數變化≥2的DEGs進行分析，通過基因本體(GO) (http://www.geneontology.org/)鑒定富集的生物學過程。最后，為了解 DEGs 相關的生物學途徑，使用由 KEGG 自動注釋服務器(KAAS)(http://www.genome.jp/tools/kaas/)運行的京都基因與基因組百科全書(KEGG)途徑分析程序來獲得功能注釋。所有表達數據的統計和可視化均通過R包軟件進行(http://www.r-project.org/)。本研究中討論的所有數據均已錄入NCBI的基因表達綜合數據庫(GEO)，收錄號為SRR5186264。

1.7 差異表達基因qRT-PCR驗證

為了驗證細菌感染氣管差異表達基因的測序結果，選擇黏附分子、細胞因子和趨化因子差異表達的基因(、34、1、3、-α、18、1R1、-1β、4、13、20、14)進行qRT-PCR，檢測這些選定基因的mRNA水平。β-actin被用作參考基因以標準化靶基因的轉錄水平。根據NCBI中雞()的參考序列使用Primer 6.0軟件設計引物，引物相關信息見表1。qRT-PCR檢測信號通路相關基因表達量的數據采用相對定量2-ΔΔ方法進行計算，使用Graph Pad Prism 8軟件展開表達量分析(在qRT-PCR反應中，設-為內參)。

表1 qRT-PCR引物

圖1 氣管中細菌的載量分析Fig.1 Analysis of bacterial load in trachea

2 結 果

2.1 MG感染雞的臨床癥狀和剖檢病變分析

雛雞在感染MG后3 d(3 dpi)均無明顯臨床癥狀出現；7 dpi，感染組個別雛雞首先出現輕微的呼吸道癥狀；15 dpi，感染組所有雞均出明顯的呼吸啰音，有4只雞表現出咳嗽、眼部腫脹等癥狀。直至全群剖殺前，各組雞均未出現死亡。

在3、5、7和15 dpi，對雛雞進行剖檢，剖檢結果顯示，感染組的雞出現不同程度的氣囊炎，氣囊顏色渾濁和氣囊壁增厚。對照組雞均無明顯病變，氣囊透明無分泌物。雛雞氣管中的細菌DNA含量統計如圖1所示，在健康雛雞氣管中未檢測到MG；但感染組樣本細菌載量在3 dpi約為1×10copies·μL，5 dpi約為1×10copies·μL，在7和15 dpi顯著增長，15 dpi 時細菌載量約為1×10copies·μL。

2.2 測序數據處理與分析

15 dpi取感染組和對照組試驗雞的氣管組織樣本進行了轉錄組測序,分別獲得了超過5 500萬條原始讀數，質控后得到讀數分別為57 745 164(98.05%)、54 132 380(98.35%)。定位到雞參考基因組，兩組分別獲得的定位讀長為48 771 234和50 886 334，定位比例分別為92.93%和91.48%，所有樣本的唯一映射讀數率均>90%。此外，所有樣本的GC含量均>50%以上，樣本的基礎質量評價指標(Q30)均>94%(表2)。均一性評估結果顯示(圖2)，reads分布曲線平滑，未出現有斷崖式上升或者下降。表明轉錄組文庫中的mRNA片段化的隨機性高，可以滿足后續分析。

表2 測序數據質控統計表

圖2 試驗樣本的Reads在參考基因上的均一化分布統計Fig.2 Homogeneous distribution statistics of reads on reference genes for test samples

2.3 差異表達基因(DEGs)篩選

使用R包中的DESeq軟件對15 dpi雛雞氣管的轉錄組數據進行差異表達分析。結果顯示，感染組與對照組之間共篩選出3 112個顯著(<0.01)差異表達基因(DEGs)，其中,1 646個上調基因，1 466個下調基因。通過MA圖顯示了DEGs的分布幅度(圖3)。通過NCBI數據庫以雞RefSeq mRNA數據庫進行blastn相似性搜索，來實現差異表達基因的注釋。

圖3 比較組表達差異基因分布火山圖Fig.3 Volcano plot of differential gene distribution in comparison group

2.4 GO功能注釋的差異性分析

使用生物信息學工具DAVID對通過DESeq分析鑒定的差異表達基因功能進行了GO分析，以產生轉錄組文庫的基因表達譜概述。根據它們的GO術語，總的差異基因被11 377個GO術語所標注，其中,1 518個GO術語為顯著富集(<0.05)，根據GO注釋將雞Unigenes分為生物過程(1 986 Unigenes)、細胞組分(2 030 Unigenes)和分子功能(1 855 Unigenes)。因為一些基因被分為一個以上的子類別，所以這些子類別中的基因總和可能超過100%。對每個功能類別的前15個GO項進行了富集，并顯示在(圖4)，生物過程類別中最豐富的GO術語包括對生物調節(1 264 Unigenes)、刺激的反應(886 Unigenes)、多細胞生物過程(758 Unigenes)和細胞成分組織或生物發生(677 Unigenes)。至于細胞組分，1 592 和1 588個Unigenes被分配到細胞和細胞部分GO術語，1 188 個Unigenes被分配到細胞器術語，1 015 個Unigenes個被分配到膜術語。在分子功能類別中，結合(1 380 Unigenes)、蛋白質結合(792 Unigenes)催化活性(774 Unigenes)是豐度最高的GO術語(圖4)。說明感染MG-HY株的雛雞氣管發生了復雜的生物學變化。

圖4 差異表達基因前15個最高的GO富集Fig.4 Top 15 highest GO enrichment of differentially expressed genes

2.5 KEGG-Pathway差異基因分析

為了鑒定雛雞的活躍生物學通路，使用KEGG注釋系統對差異表達的Unigenes進行映射。對3 112個Unigenes進行KEGG注釋，以(<0.01)為條件判定差異表達基因Pathway富集的顯著性(圖5)。結果表明，有827個Unigenes顯著富集于30條的通路中，其中，幾個高代表性的通路與雞的黏膜免疫系統有關，包括細胞因子-細胞因子受體相互作用(240 Unigenes)，細胞黏附分子(CAMs)(178 Unigenes)，細胞外基質(ECM)受體相互作用(142 Unigenes)、緊密連接(178 Unigenes)、PPAR信號通路(48 Unigenes)和MAPK信號通路(12 Unigenes)等(表3)。對這些途徑的分析表明，MG感染影響了宿主氣管免疫防御反應相關信號通路，使氣管正常的生理活動和穩態受到異常調節，最終破壞氣管組織形態結構并引起嚴重的炎癥。

圖5 差異表達基因的KEGG顯著性注釋(top30)Fig. 5 KEGG significance annotation of differentially expressed genes (top30)

表3 免疫相關通路及其相關差異表達基因的富集

2.6 qRT-PCR對DEGs的驗證

為了驗證轉錄組測序的可靠性，對選擇黏附分子、細胞因子和趨化因子差異表達的基因(、34、1、3、-α，18、1R1、-1β、4、13、20、14)進行qRT-PCR檢測。結果如圖6所示，qRT-PCR檢測結果與通過RNA-seq數據的結果趨勢一致。從而證實了轉錄組測序結果的可靠性。

A.趨化因子mRNA相對水平；B.細胞因子mRNA相對水平；C.黏附分子mRNA相對水平A. Relative chemokine mRNA level； B.Relative cytokines mRNA level；C.Relative icytadherence molecules mRNA level圖6 qRT-PCR 驗證 RNA-Seq 中的差異表達基因Fig. 6 qRT-PCR validation of differentially expressed genes in RNA-Seq

3 討 論

MG是家禽慢性呼吸道疾病的主要病原體，感染后會造成巨大的經濟損失。在禽類呼吸系統中，氣管充當與外界氣體交換的通道，也是抵御外源污染物的第一道防線，因此使其成為MG攻擊的首要目標。本實驗室前期研究發現MG感染引起雛雞氣管明顯的組織學病變：包括雛雞氣管纖毛脫落、結構破壞、黏膜炎性細胞浸潤等，導致氣管炎癥和呼吸功能障礙。本研究為了進一步探究MG感染對雞氣管黏膜上皮損傷和黏膜免疫的作用機制，首先使用雞毒支原體感染SFP雛雞，隨后，通過轉錄組測序分析(RNA-seq)探索了感染組和對照組雞氣管的全面基因表達譜。將 DEGs 進行功能注釋和分類，篩選出與免疫相關的通路及其差異表達基因，對雛雞氣管與MG之間的互作機制提供了新的見解。

動物試驗結果顯示，MG感染組，15 dpi 的所有雛雞出現典型的臨床癥狀和剖檢病變：明顯的呼吸啰音，咳嗽、眼部腫脹等癥狀，氣囊增厚、積液，與先前研究結果一致。同樣，研究表明，菌液接種后，MG在雛雞氣管內也顯著增殖，感染組樣本細菌載量在15 dpi對比3 dpi呈現4倍增長。說明細菌在氣管內增殖與氣管黏膜病變成正相關。然而，MG在宿主體內致病的機制研究仍不充分。

為了深入了解宿主的轉錄組譜如何響應MG感染的變化，作者運用RNA-seq技術對感染組和對照組的雞氣管組織進行轉錄組分析。在感染組和對照組的雞氣管組織中共鑒定出3 112個顯著(<0.01)差異表達基因(DEGs)，其中,1 646個上調基因，1 466個下調基因(圖3)。數據分析顯示，這些DEGs顯著富集于免疫相關術語和途徑，可能在抵抗MG感染中發揮重要作用。根據GO富集分析的結果顯示，參與黏膜免疫應答子類別中差異基因顯著失調，主要體現在生物調節、刺激的反應、多細胞生物過程、細胞成分組織或生物發生等生物過程。這表明MG定植在宿主氣管的過程中，改變了宿主細胞膜的穩定性。先前的研究報道了MG脂質相關膜蛋白(LAMPs)是MG主要的毒力因子之一，它們可以刺激宿主細胞產生促炎細胞因子并誘導細胞凋亡和壞死。本研究中，MG通過LAMPs與細胞受體結合后介導雞氣管上皮細胞的炎癥反應，刺激下游信號通路幾種促炎細胞因子(IL-1β、INF-α、IL18、IL1R1)和趨化因子(CCL20、CXCL13、CXCL14、CCL4)的活化。因此，誘導炎癥細胞的激活和募集是MG發病機制的關鍵。

大多數已鑒定的DEGs參與宿主黏膜上皮免疫防御反應(≤0.01)，如表3所示。當在生物學途徑的背景下進行分析時差異基因顯著富集于細胞因子-細胞因子受體相互作用，細胞黏附分子(CAMs)，細胞外基質(ECM)受體相互作用、緊密連接、PPAR信號通路、MAPK信號通路和p53信號通路等。對這些途徑的分析表明，在疾病發展過程中MG可能刺激一種或多種生理過程并引起氣管免疫防御反應。免疫相關通路富集的DEGs在防御MG感染的潛在致病機制中發揮重要作用。細胞黏附分子是免疫系統的重要信號傳遞者，它們起到將抗原信號從細胞外傳遞到細胞內的作用。本研究發現，許多顯著富集在細胞黏附分子通路中，具有病原體識別、信號傳遞和調控白細胞與血管內皮細胞黏附等功能的黏附分子，包括ALCAM、CD34、NECTIN1和CDH3，在MG感染組雛雞氣管組織中下調。研究證實當黏附分子功能被下調后，宿主抗原呈遞和加工能力會降低，使病原體逃避宿主的免疫系統進入呼吸道上皮細胞使其致病。

宿主氣管黏膜免疫應答的一個重要特征是參與炎癥反應的DEGs活性增強，通過將免疫細胞吸引到炎癥部位，直接參與炎癥反應，并促進免疫反應和傷口愈合。在本研究中檢測到，主要富集于細胞因子-細胞因子受體相互作用信號通路的炎癥因子和趨化因子，如IL18、IL1R1、TNF-α、IL-1β、CCL4和CXCL13等，在感染MG的雛雞的氣管組織中表達增強。IL18和IL1R1是促炎介質，參與許多細胞因子誘導的免疫和炎癥反應。TNF-α和IL-1β具有調節免疫應答功能，并在機體的抗感染免疫反應中起重要作用；CCL4和CXCL13等趨化因子可以將免疫細胞募集到感染部位，進一步促進免疫細胞浸潤，加劇氣管組織病變。MG感染后CXCL14的表達量降低了6倍，這與其他顯著上調的趨化因子形成鮮明對比，如CXCL13(4倍)，CCL4(3.5倍)和CCL20(3倍)。CXCL14在上皮組織中的穩定表達和高豐度，是一種針對呼吸道細菌的高活性抗菌肽(AMP)，有助于肺部的細菌清除。然而，尚未有任何關于家禽感染后產生的炎癥刺激使趨化因子被抑制的報道。本研究CXCL14 mRNA表達水平受到炎癥刺激的顯著抑制，據此，作者推測CXCL14是在維持上皮組織穩態中發揮作用，在炎癥條件建立之前就發揮滅菌功能，而不是直接參與炎癥反應驅動的免疫過程，具體作用機制有待進一步驗證。這些免疫相關的DEGs有助于闡明MG感染后雛雞的免疫反應，但是，MG感染后通常無法清除，伴隨著持續性免疫原性炎癥使禽類易于合并感染其他病原體并導致CRD的發展。

本研究不僅豐富了雞現有的序列信息數據，并且為進一步完善MG 感染導致宿主氣管上皮損傷和黏膜免疫機制提供依據。然而，仍然需要探索雞毒支原體誘導強烈宿主反應的關鍵成分，雛雞氣管黏膜免疫的潛在機制也需要進一步研究證實。

4 結 論

運用RNA-seq探索了感染組和對照組雞氣管的全面基因表達譜。將 DEGs進行功能注釋和分類，鑒定出1 646個上調基因和1 466個下調基因。差異基因主要涉及生物調節、對刺激的反應、多細胞生物過程和細胞成分組織或生物發生等生物學過程和氣管黏膜免疫相關信號通路。