蛋清溶菌酶淀粉樣纖維對人神經母細胞瘤細胞的毒性

白 瑜，王 武，王 碧，李 穎，馮自立

(陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西省資源生物重點實驗室，漢中 723000)

20多種蛋白質或多肽可以發生結構錯誤折疊形成淀粉樣纖維，這些淀粉樣纖維沉積在機體組織或器官內可導致相應的淀粉樣變性疾病(amyloidosis)，如機體內正常存在的朊蛋白(prion protein)發生錯誤折疊后形成了淀粉樣纖維，這種纖維聚集在中樞神經系統導致了人或動物的傳染性海綿狀腦病(transmissible spongiform encephalopathy，TSE)，也稱朊病 (prion disease)。p. Leu102Ser突變的人溶菌酶(human lysozyme)蛋白也可形成淀粉樣纖維，導致家族性淀粉樣變性疾病。淀粉樣纖維的形成是導致淀粉樣變性疾病的關鍵原因。淀粉樣纖維相關蛋白質或多肽也可在體外一定理化條件下形成淀粉樣纖維，如朊蛋白多肽PrP106-126在37 ℃、pH 7.5的磷酸緩沖液中孵育24 h可形成淀粉樣纖維，人溶菌酶蛋白在高溫57 ℃、pH 7.4條件下能夠形成淀粉樣纖維。蛋清溶菌酶(hen egg-white lysozyme，HEWL)與人溶菌酶蛋白在序列上有60.94%的相似性，蛋清溶菌酶蛋白在一定理化條件下也可形成淀粉樣纖維，且形成的淀粉樣纖維超微結構與朊蛋白淀粉樣纖維及導致阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的Aβ(β-amyloid protein，Aβ)淀粉樣纖維有極大相似性。蛋清溶菌酶蛋白有129個氨基酸，二級結構α螺旋含量30%～40%。正常朊蛋白中α螺旋約含42%，在其結構錯誤折疊過程中，一部分α螺旋轉化成了β折疊，導致朊蛋白淀粉樣纖維中的α螺旋含量減少、β折疊含量顯著提高。蛋清溶菌酶蛋白在形成淀粉樣纖維過程中β折疊含量也顯著提高。蛋清溶菌酶蛋白已經作為模型材料用于研究蛋白質結構錯誤折疊并組裝成淀粉樣纖維的過程。然而蛋清溶菌酶蛋白形成的淀粉樣纖維對細胞的生物學活性鮮見報道。因此本研究使用朊蛋白以及Aβ淀粉樣纖維研究中常用的人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y，探討一定理化條件下形成的蛋清溶菌酶淀粉樣纖維對SH-SY5Y神經細胞的影響，為探究朊蛋白和其他蛋白質淀粉樣纖維的形成機制及其致病性提供線索。

1 材料與方法

1.1 主要材料

SH-SY5Y細胞購自上海酶研生物科技有限公司(編號CC-Y1459)，蛋清溶菌酶(EC 3.2.1.17)購自MCE公司，8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)購自SIGMA公司，甘氨酸購自MP公司，MEM/F-12培養基、Gluta-max添加劑、丙酮酸鈉(sodium pyruvate)、非必需氨基酸(non-essential amino acids，NEAA) 和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自Gibco公司，MTT試劑盒、Hoechst 33342染色液購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 主要儀器

T12透射電子顯微鏡購自FEI公司，Jasco-1500圓二色譜儀購自日本株式會社，Epoch紫外酶標儀購自美國Bio Tek，Cary Eclipse熒光分光光度計購自安捷倫科技有限公司，OS60恒溫孵育搖床購自北京萊普特公司，Ti-S倒置熒光顯微鏡購自日本Nikon。

1.3 蛋清溶菌酶淀粉樣纖維制備

使用pH 2.0的50 mmol·L甘氨酸溶液配制1 mmol·L天然蛋清溶菌酶蛋白作為儲備溶液。然后將100 μmol·L蛋清溶菌酶蛋白置于(57±0.1)℃、250 r·min搖床中孵育，每2 d收集孵育樣品，于-20 ℃保存。

1.4 透射電鏡觀察超微結構

取15 μL孵育的HEWL樣品緩慢滴加于200目無碳方華膜上，待樣品表面風干，以磷鎢酸(phosphotungstic acid，PTA)負染30 s，吸去多余的染液后，再以超純水清洗20 s，室溫下干燥，使用透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy, TEM)在100 kV電壓下觀察淀粉樣纖維的超微結構。

1.5 疏水性檢測

使用ANS熒光試劑檢測淀粉樣纖維表面的疏水性，ANS熒光強度增加表示纖維的疏水性增強。以超純水稀釋HEWL樣品至終濃度為1 μmol·L，ANS使用濃度為10 μmol·L，HEWL樣品和ANS混勻后于室溫下避光孵育3 min，最后使用熒光分光光度計進行ANS熒光掃描，激發波長為380 nm， 波長范圍為420～600 nm，激發狹縫為5 nm， 發射狹縫為5 nm。

1.6 二級結構檢測

使用圓二色譜法(Circular dichroism，CD)檢測蛋白質二級結構，檢測方法參考李穎等方法。然后使用儀器自帶的CD multivariate SSE軟件計算預測二級結構中α螺旋和β折疊的含量。

1.7 神經細胞培養及纖維處理

SH-SY5Y細胞在37 ℃、5% CO的培養箱中培養，完全培養基：MEM/F12 培養基、1% Gluta-max、1% sodium pyruvate、1% NEAA、10%胎牛血清和1%雙抗。正常培養24 h 之后進行各組試驗處理。

將4～10 d不同聚集程度的蛋清溶菌酶淀粉樣纖維混合均勻，然后使用冷凍干燥機將纖維凍干處理，再將凍干的纖維溶解于完全培養基。纖維使用濃度分別為1、2和3 μmol·L，處理時間分別為12、24和48 h。pH 2.0甘氨酸溶液經相同凍干處理后作用于SH-SY5Y細胞作為陰性對照。正常培養細胞作為空白對照組，每組6個重復。

1.8 細胞毒性檢測

SH-SY5Y細胞在96孔板中的接種密度為5×10·孔。按照MTT試劑盒操作說明，含90 μL培養基的細胞孔中加入10 μL MTT(5 mg·mL)至終濃度為0.5 mg·mL，繼續培養4 h后吸棄含有MTT的舊培養基，然后加入100 μL甲瓚溶解劑(formazan solubilization solution)，輕輕振蕩10 min 以溶解沉淀物，最后使用酶標儀測定570 nm的吸光度。細胞活力計算公式：細胞活力(%)=(OD/OD) ×100。

1.9 Hoechst 33342核染色

分別使用2 和3 μmol·L的淀粉樣纖維處理細胞48 h后，吸棄舊培養基，無菌D-PBS洗滌細胞1次，加入Hoechst 33342染色液后在室溫條件下避光孵育30 min，最后置于倒置熒光顯微鏡下觀察染色后的細胞核。

1.10 統計學分析

2 結 果

2.1 HEWL纖維的超微結構

HEWL蛋白在57 ℃、pH 2.0甘氨酸溶液中孵育，4 d后，在TEM下觀察到少量淀粉樣纖維結構(圖1 A)，8～10 d后觀察到大量纖維(圖1 B和C)，且4、8和10 d形成的纖維超微結構相同，均呈短桿狀，直徑約20 nm，纖維中心有長軸。經凍干處理后，淀粉樣纖維的超微結構保持不變(圖1 D)。

A. 4 d；B. 8 d；C. 10 d；D. 凍干后的HEWL淀粉樣纖維A. 4 d；B. 8 d；C. 10 d；D. HEWL fibrils after lyophilization圖1 HEWL淀粉樣纖維的超微結構Fig.1 Ultrastructures of HEWL fibrils

2.2 HEWL纖維的疏水性

天然HEWL蛋白與ANS熒光試劑結合后產生的熒光強度較低，而HEWL淀粉樣纖維與ANS結合后產生的熒光強度顯著增加，且8 d時纖維產生的ANS熒光強度明顯高于4 d時(圖2)，表明HEWL蛋白在形成淀粉樣纖維之后的疏水性明顯提高，且隨著纖維數量增多，疏水性增強。

圖2 ANS熒光法檢測HEWL淀粉樣纖維的疏水性Fig.2 Hydrophobicity of HEWL fibrils by ANS fluorescence method

2.3 HEWL纖維的二級結構含量變化

圓二色譜檢測結果顯示，天然HEWL蛋白(0 d) 在約208 nm處出現最低橢圓率，表示二級結構中主要是α螺旋(圖3)，使用圓二色譜儀(Jasco-1500)自帶CD multivariate SSE軟件計算的α螺旋和β折疊含量分別為30.6%和20.8%(表1)。4和8 d形成的HEWL纖維在約218 nm處出現最低橢圓率，表示二級結構中主要是β折疊，且4 d時HEWL纖維的α螺旋和β折疊含量分別為22.5%和29.6%，8 d時分別為12.8%和37.1%，表明隨著HEWL纖維的形成和生長，α螺旋含量逐漸降低，而β折疊含量逐漸升高。

圖3 HEWL淀粉樣纖維的二級結構測定Fig.3 Secondary structure detection of HEWL fibrils by CD method

2.4 HEWL纖維對SH-SY5Y細胞的毒性

將4～10 d產生的HEWL淀粉樣纖維混合后以不同濃度處理培養的SH-SY5Y細胞。1、2和3 μmol·LHEWL淀粉樣纖維分別處理細胞12、24和48 h后均極顯著降低了細胞活力(<0.01)，處理12 h的細胞活力分別為75.16%±15.51%、67.54%±12.13%和67.89%±10.26%(圖4 A)；處理24 h的細胞活力分別為75.78%±13.01%、58.41%±5.55%和61.90%±8.94%(圖4 B)，處理48 h的細胞活力分別為71.59%±14.75%、55.65%±5.78%和46.45%±6.23%(圖4 C)。pH 2.0甘氨酸溶液作為陰性對照，處理細胞48 h未影響SH-SY5Y細胞的細胞活力(>0.05)。結果表明：HEWL淀粉樣纖維對SH-SY5Y神經細胞具有較強的毒性，且毒性呈時間依賴性和纖維濃度依賴性。

表1 二級結構含量變化

A. 12 h；B. 24 h；C. 48 h；pH 2.0甘氨酸溶液作為陰性對照；數據以表示(n=6)，與空白對照組相比，**.P<0.01A. 12 h；B. 24 h；C. 48 h；Glycine solution of pH 2.0 as the negative control；Data were expressed as (n=6), compared with control, **.P<0.01圖4 HEWL淀粉樣纖維對細胞活力的影響Fig.4 Effects of HEWL amyloid fibrils on cell viability

同時，HEWL纖維處理SH-SY5Y神經細胞48 h之后，顯微鏡下觀察細胞形態發現：空白對照組和陰性對照組的SH-SY5Y神經細胞生長正常，細胞呈梭形，神經突起細長并相互交聯成網絡狀(圖5 A和5 B)，而2～3 μmol·LHEWL纖維處理組的細胞胞體變圓且體積收縮，神經突起斷裂導致細胞間交聯消失，甚至細胞數量減少(圖5 C和5 D)。Hoechst 33342核染色結果顯示：HEWL纖維在處理SH-SY5Y神經細胞48 h之后，空白對照組(圖5A)和陰性對照組(圖5 B)細胞的細胞核均發出微弱、彌散、均勻的藍光，且染色質分布均勻，細胞核正常；2 μmol·L(圖5 C)和3 μmol·L(圖5 D)的HEWL纖維導致細胞核出現核濃縮、核碎裂、染色質邊移等典型的細胞凋亡特征，且與空白對照組相比，視野下細胞數量明顯減少。該結果進一步表明HEWL纖維可造成SH-SY5Y神經細胞的明顯凋亡。

A. 空白對照組；B. 陰性對照組；C. 2 μmol·L-1 HEWL纖維處理組；D. 3 μmol·L-1 HEWL纖維處理組。第一行為Hoechst 33342核染色結果；第二行是白光視野圖；箭頭所示為凋亡細胞A. Control；B. Negative control；C. 2 μmol·L-1 HEWL fibrils；D. 3 μmol·L-1 HEWL fibrils. The pictures in the first row are the results of Hoechst 33342 nuclear staining; The pictures in the second row are the results of white light field; White arrows indicated the apoptotic cells圖5 HEWL淀粉樣纖維引起的細胞形態學變化Fig.5 Morphological changes of cells induced by HEWL amyloid fibrils

3 討 論

淀粉樣纖維在體內主要沉積于細胞間質，導致細胞淀粉樣變(amyloid change)。朊蛋白淀粉樣纖維和Aβ淀粉樣纖維不僅在形態學上相同，而且在理化屬性上具相似性，包括疏水性增強和β折疊含量提高。與淀粉樣變性疾病不相關的蛋清溶菌酶蛋白在一定理化條件下也能夠發生去折疊過程形成淀粉樣纖維，已經作為蛋白模型材料來研究淀粉樣纖維的形成機制。

本研究使用蛋清溶菌酶蛋白在57 ℃、pH 2.0甘氨酸溶液孵育4 d后形成了淀粉樣纖維，孵育8～10 d后纖維大量形成，纖維的超微結構呈短桿狀且中心有軸, 直徑約20 nm，與朊蛋白纖維和Aβ淀粉樣纖維的超微結構相似，證明了由不同結構和功能的蛋白質形成的淀粉樣纖維在形態學上極相似。分子動力學模擬和試驗研究都證實了朊蛋白易在高溫、酸性條件下形成淀粉樣纖維，如朊蛋白多肽H2(helix 2，H2)在pH 2.9條件下形成了淀粉樣纖維。與朊蛋白相似，蛋清溶菌酶蛋白在高溫及酸性條件下能夠形成淀粉樣纖維，如57 ℃、 pH 2.2，65 ℃、pH 2.0和45～55 ℃、pH 3.8等條件；Feng等研究表明，pH 2.2甘氨酸溶液中57 ℃比45 ℃較易形成淀粉樣纖維。高溫和酸性環境可以通過改變蛋白質的構象穩定性和蛋白質間相互作用以促進蛋白質的部分變性和去折疊過程，進一步誘導蛋白質聚集和形成淀粉樣纖維。因此，高溫和酸性環境是影響淀粉樣纖維形成的兩個重要因素。此外，與天然HEWL蛋白相比，HEWL淀粉樣纖維表面的疏水性增強，且8 d時的疏水性高于4 d，表明高溫和酸性環境使蛋白質的疏水區域暴露程度增加，進一步驅動了纖維的形成和生長，證實了疏水區域暴露程度的增加能夠促進蛋白質的去折疊和錯誤折疊過程；經圓二色譜法測定并使用自帶CD multivariate SSE軟件計算預測顯示，與天然HEWL蛋白二級結構含量相比，孵育4和8 d的二級結構α螺旋含量分別降低了8.1%和17.8%，而β折疊含量分別提高了8.8%和16.3%，表明隨著HEWL淀粉樣纖維的形成和生長，一部分α螺旋結構轉變成了β折疊結構，這與朊蛋白形成淀粉樣纖維時發生了二級結構從α螺旋轉化成β折疊的過程相似。分子動力學模擬證實β折疊結構的形成驅動了蛋白組裝成淀粉樣纖維，因此，α螺旋轉變成β折疊也是HEWL淀粉樣纖維形成的重要驅動力。

該HEWL淀粉樣纖維對培養的SH-SY5Y神經細胞產生了明顯的毒性作用。HEWL纖維在較低濃度1 μmol·L處理細胞12 h已引起了極顯著的細胞毒性，當處理時間延長至24和48 h時，或者使纖維濃度增加至2和3 μmol·L時，細胞毒性效果均逐漸增強，表明HEWL淀粉樣纖維對SH-SY5Y神經細胞的毒性作用呈現時間依賴性和濃度依賴性；細胞形態學變化結果進一步證明，HEWL淀粉樣纖維引起了SH-SY5Y神經細胞的凋亡。而使用pH 2.0甘氨酸溶液作為陰性對照，處理SH-SY5Y細胞48 h后未產生明顯的影響，表明神經細胞毒性是由HEWL淀粉樣纖維引起的。

4 結 論

蛋清溶菌酶蛋白在一定理化條件下可形成具有神經細胞毒性的淀粉樣纖維。作者推測淀粉樣纖維的神經細胞毒性取決于纖維結構本身，而不依賴于蛋白質的化學結構和功能。然而HEWL淀粉樣纖維對SH-SY5Y神經細胞的毒性機制有待進一步研究。