金黃色葡萄球菌對BV2細胞IFN-α生成的影響

盧婉青，趙莎莎，蔣松宏，童智子，黃丹妮，郭建華, 2，吳俊偉，周 洋, 2*

(1. 西南大學動物醫學院，重慶 402460；2. 西南大學醫學研究院免疫學研究中心，重慶 402460)

金黃色葡萄球菌(，簡稱金葡菌)是革蘭陽性菌，廣泛存在于動物皮膚和黏膜以及環境中，生存能力強，易產生耐藥性，釋放如腸毒素A、α-溶血素、凝集因子A和殺白細胞素等多種毒素，可引起多種感染性疾病，嚴重者可導致膿毒血癥、敗血癥或肺炎，危及生命。

IFN是宿主防御時生成的細胞因子，在免疫監視和啟動對病原的免疫應答過程中發揮重要作用。IFN分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，與其受體相互作用后刺激細胞內和細胞間信號轉導網絡，調控天然免疫和獲得性免疫，觸發抗感染活性。Ⅰ型IFN最初作為干擾病毒增殖的可溶性因子發現，由天然免疫細胞合成。Ⅰ型IFN家族包括多個結構相似的成員，基因存在于人的9號染色體和小鼠的4號染色體， IFN-α主要由白細胞生成，如淋巴細胞、單核細胞和粒細胞，巨噬細胞源自單核細胞，因此白細胞稱為天然的IFN生成細胞，IFN-α稱為白細胞IFN。IFN-α有13個亞型，研究非常廣泛，其中，IFN-α4直接受IFN調節因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)調控，是微生物感染后最早生成的IFN。Ⅰ型IFN的生成受到TANK結合激酶1(Tank-binding kinase 1，TBK1) /IRF3通路的調控。位于內質網的干擾素基因刺激蛋白(stimulator of IFN genes，STING)識別胞內雙鏈DNA，募集并磷酸化TBK1，TBK1激活后與IRF3相互作用，導致IRF3磷酸化和NF-κB通路激活，促進Ⅰ型IFN的生成。靜息狀態下，NF-κB與NF-κB抑制劑α(inhibitor of κBα，IκBα)結合處于失活狀態，細胞受到刺激時，IκBα發生磷酸化和泛素化，NF-κB與其脫離后激活。金葡菌感染后促進樹突狀細胞和呼吸道上皮細胞生成Ⅰ型IFN。金葡菌可入侵豬和人的中樞神經系統引起腦部感染，如腦膜炎，但該菌感染小膠質細胞后對Ⅰ型IFN通路的影響尚不清楚。本研究表明，金葡菌感染小鼠小膠質細胞BV2后促進IFN-α生成，該過程依賴于TBK1和NF-κB通路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

BV2細胞和金葡菌由本實驗室保存。

DMEM高糖培養基(C11995500BT)購自Gibco，胎牛血清(P30-3302)購自PAN，胰酶(T8150)和總RNA提取試劑盒(R1200)購自北京索萊寶生物科技有限公司，Mueller-Hinton肉湯(MHB，HB6231)和Mueller-Hinton瓊脂(MHA，HB6232)購自青島海博生物技術有限公司，化學發光液檢測試劑盒(WBKlS0100)購自millipore，BX-795(14932)、IMD-0354(17290)和amlexanox(14181)購自Cayman，反轉錄試劑盒(R312)和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Q711)購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，小鼠IFN-α ELISA試劑盒(SEKM-0149)購自Thermo Fisher。TBK1(ab235253)、p-TBK1(ab109272)抗體購自Abcam，β-actin(66009)、IκBα(10268)和IRF3(113112)抗體購自proteintech，p-IκBα(AP0614)和p-IRF3(AP0623)抗體購自Abclonal，辣根酶標記山羊抗兔IgG(ZB-2301)購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

垂直電泳儀購自Bio-Rad，化學發光成像儀購自Vilber。

1.2 細胞、細菌培養和感染

BV2細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基置于二氧化碳培養箱培養，二氧化碳濃度5%，細胞匯合度到90%左右時傳代，2 d傳代一次。金葡菌在MHA平板劃線，挑取單克隆接種到MHB 37 ℃過夜培養，50倍稀釋培養2.5 h，12 000 r·min離心2 min，PBS洗滌3次，根據試驗中指定的MOI加入一定體積的完全培養基，重懸后加入到細胞中，感染后30 min用37 ℃預熱PBS洗滌3次，加入含100 μg·mL慶大霉素的完全培養基繼續培養至收樣。

1.3 Western blot

10 μL樣品加入到SDS-PAGE電泳，蛋白轉印到PVDF膜上，5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，一抗(TBK1和p-TBK1抗體5 000倍稀釋，其他抗體1000倍稀釋)4 ℃孵育過夜，TBST(NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Tris base 3 g，Tween-20 1 mL，超純水1 L，鹽酸調pH7.4)洗滌5次，每次5 min，二抗(10 000倍稀釋)37 ℃孵育1 h，TBST洗滌5次，每次5 min， 滴加化學發光液，化學發光成像儀曝光。

1.4 實時熒光定量PCR

按照說明書提取總RNA，反轉錄得到cDNA，實時熒光定量PCR體系：ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各0.4 μL，超純水 8.6 μL。引物序列如表1所示，反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。-作為內參，相對定量法(2-ΔΔ)分析。IFN-α分別檢測-α4和-αn(包括5個亞型，分別為IFN-α1、α2、α7、α11和α12)。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.5 小鼠IFN-α ELISA

細胞培養液上清1 000 ×離心10 min，取上清，按照試劑盒說明書檢測IFN-α濃度。

1.6 數據分析

Image pro plus進行蛋白灰度分析。試驗數據經Excel整理，檢驗分析差異，*表示差異顯著(0.01<<0.05),**表示差異極顯著(<0.01)，GraphaPad prism作圖。

2 結 果

2.1 金葡菌促進BV2表達IFN-α

為探明BV2感染金葡菌后IFN-α表達水平的變化，首先檢測了金葡菌感染后不同時間點IFN-α的轉錄水平。結果表明，感染后1 h，IFN-α轉錄水平沒有變化，3～6 h轉錄水平逐漸上升，12 h降低(圖1A)。分別用MOI為8、40和200的金葡菌感染BV2時，IFN-α的轉錄水平上升呈現劑量依賴性(圖1B)。BV2感染金葡菌后ELISA法檢測細胞培養液中IFN-α水平發現，感染后1～3 h，IFN-α水平沒有變化，6～12 h釋放進入培養液中的IFN-α逐漸上升(圖1C)。BV2感染不同MOI的金葡菌時，IFN-α的釋放量隨著MOI的升高而增加(圖1D)。

NC表示陰性對照；S.A.表示金葡菌；*.0.01

2.2 金葡菌激活BV2 TBK1/IRF3通路

為闡明金葡菌感染BV2細胞后是否通過該通路誘導IFN-α的生成，首先檢測了1和3的轉錄水平。結果表明，BV2感染金葡菌后1～12 h范圍內，1和3的轉錄水平沒有發生變化(圖2A、B)。Western blot檢測蛋白水平結果表明，感染后1～12 h，TBK1和IRF3的蛋白水平沒有變化，但感染后1 h，TBK1和IRF3磷酸化水平開始升高，在1～6 h逐漸升高，12 h下降，但均高于陰性對照組(圖2C～E)。分別用MOI為8、40和200的金葡菌感染BV2細胞，6 h后TBK1和IRF3磷酸化水平的升高呈劑量依賴性(圖2F～H)。以上結果表明，金葡菌感染BV2細胞后激活TBK1/IRF3通路。

圖2 金葡菌感染BV2細胞后激活TBK1/IRF3通路Fig.2 S. aureus activates TBK1/IRF3 pathway following infection in BV2 cells

2.3 金葡菌促進BV2細胞生成IFN-α需要TBK1

為探究TBK1在金葡菌誘導BV2細胞生成IFN-α中的作用，分別用2種TBK1抑制劑BX-795和amlexanox處理細胞后再感染金葡菌。結果表明，BX-795抑制TBK1磷酸化后(圖3A和3B)，IRF3蛋白水平沒有變化，但其磷酸化水平降低(圖3A和3C)，同時，IFN-α釋放量減少(圖3D)。aml-exanox處理BV2后，TBK1磷酸化水平沒有變化(圖3E和3F)，p-IRF3蛋白水平下降(圖3E和3G)，IFN-α釋放量減少(圖3H)。上述結果表明，TBK1參與BV2感染金葡菌后生成IFN-α。

A～D. BX-795處理；E～H.Amlexanox處理A-D. Treatment with BX-795; E-H. Treatment with amlexanox圖3 金葡菌誘導BV2細胞生成IFN-α需要TBK1Fig.3 TBK1 is required for S. aureus-induced IFN-α production in BV2 cells

2.4 金葡菌促進BV2細胞生成IFN-α依賴于NF-κB通路

TBK1激活后介導NF-κB通路活化，促進Ⅰ型IFN的生成。為探明BV2細胞感染金葡菌后生成IFN-α是否依賴于NF-κB通路，首先檢測金葡菌感染后是否激活該通路。BV2感染金葡菌后1～12 h，IκBα蛋白水平沒有升高，但感染后1 h，p-IκBα蛋白水平開始上升，在1～6 h逐漸升高，12 h略有下降(圖4A、B)。為闡明感染金葡菌后IFN-α生成與NF-κB通路激活的關系，用IMD-0354處理BV2后感染金葡菌。結果表明，該抑制劑處理細胞后，p-IκBα 蛋白水平降低(圖4C、D)，同時伴隨p-TBK1和p-IRF3蛋白水平降低(圖4C、E和F)，并且IFN-α生成減少(圖4G)。以上結果表明，BV2細胞感染金葡菌后促進IFN-α生成依賴于NF-κB通路。

圖4 金葡菌促進BV2細胞生成IFN-α依賴于NF-κB通路Fig.4 S. aureus-induced IFN-α production is dependent on NF-κB pathway in BV2 cells

3 討 論

巨噬細胞是細菌等微生物侵入機體后機體防御的第一道防線，在清除病原、維持機體穩態過程中發揮關鍵作用。小膠質細胞是腦中常駐巨噬細胞，起源于骨髓單核細胞和骨髓造血干細胞，通過自我更新保持一定數量，不通過循環的血祖細胞分化。BV2細胞是用攜帶致癌基因v-raf/v-myc的反轉錄病毒J2感染原代小鼠小膠質細胞獲得的永生化細胞，常作為替代原代小膠質細胞研究的工具細胞。金葡菌感染可引起人和動物中樞神經系統感染，如腦膜炎，但金葡菌對小膠質細胞的作用尚沒有報道，因此本研究通過探索BV2細胞感染金葡菌后Ⅰ型干擾素通路的變化闡明BV2在機體感染金葡菌后發揮的機體防御作用。

Ⅰ型IFN在機體防御細菌感染過程中發揮重要作用。機體感染嗜肺軍團菌、鏈球菌、肺炎雙球菌和大腸桿菌后，Ⅰ型IFN的生成增加，抑制細菌的增殖，促進細菌從體內清除。然而，金葡菌可通過操作宿主的免疫系統促進自身的增殖，如自噬和凋亡。金葡菌能入侵吞噬細胞并利用胞內環境促進自身存活和擴散。在樹突狀細胞中，金葡菌通過Toll樣受體9(toll-like receptor 9，TLR9)激活Ⅰ型IFN通路，與野生型小鼠比較，Ⅰ型IFN受體敲除小鼠感染金葡菌后，肺中載菌量下降約20倍，支氣管肺泡灌洗液中載菌量更低，死亡率降低70%。本研究發現，金葡菌感染BV2后激活Ⅰ型IFN通路，IFN-α轉錄水平和釋放量升高。

TBK1/IRF3通路介導Ⅰ型IFN的生成，TBK1和IRF3通過翻譯后修飾——磷酸化激活。BV2感染金葡菌后1～12 h，TBK1和IRF3在mRNA 和蛋白水平均沒有發生變化，但感染后1 h發生磷酸化，IFN-α在感染后3 h mRNA水平升高，6 h釋放量顯著增加，表明金葡菌激活TBK1/IRF3通路介導IFN-α釋放。與此一致的是，TLR4受體激動劑LPS和TLR3受體激動劑poly(I:C)處理小鼠骨髓源巨噬細胞(bone marrow-derived macrophage，BMDM)，或水皰性口炎病毒感染HEK293T細胞，TBK1和IRF3蛋白水平沒有變化，但介導其發生磷酸化促進了IFN-α釋放。

TBK1與ATP結合后促進IRF3磷酸化。Amlexanox通過競爭性結合ATP抑制TBK1活性，但不降低TBK1磷酸化水平，p-IRF3水平下降，是臨床上用于治療癌癥的候選藥物。Amlexanox處理BV2后感染金葡菌，p-TBK1水平沒有變化，p-IRF3水平降低，IFN-α生成減少，同時，BX-795處理細胞感染金葡菌后，p-TBK1和p-IRF3水平以及IFN-α生成量均下降，表明TBK1參與金葡菌促進BV2細胞生成IFN-α。

NF-κB在不同微生物激活Ⅰ型干擾素通路中的作用存在差異。一方面，小鼠巨細胞病毒感染成纖維細胞后，M35蛋白入核，抑制NF-κB活化，從而減少Ⅰ型干擾素的表達。從敲除NF-κB相關蛋白(如RelA、RelB和c-Rel)的小鼠分離的成纖維細胞感染仙臺病毒或新城疫細胞，IFN-β的生成下降較少，表明NF-κB在仙臺病毒或新城疫細胞誘導I型干擾素生成中的作用較小。另一方面，甲型流感病毒激活NF-κB，促進細胞因子信號轉導抑制蛋白3(suppressor of cytokine signaling-3，SOCS-3)表達，抑制Ⅰ型干擾素表達。β-聯蛋白(β-catenin)與p300轉錄輔因子互作，結合IFN-β啟動子，促進IFN-β表達，甲型流感病毒通過激活NF-κB抑制過表達β-聯蛋白誘導的IFN-β表達水平升高。本研究發現，金葡菌誘導BV2細胞生成IFN-α需要NF-κB的參與。

4 結 論

BV2細胞感染金葡菌后，激活TBK1/IRF3和NF-κB通路，促進IFN-α的生成。