PLCγ1基因對綿羊早期胚胎體外發育的影響

吳曉雪，袁利明，劉欣杰，劉素平，陳 寧，賽務加甫

(石河子大學動物科技學院，石河子 832000)

哺乳動物卵母細胞從成熟發育到早期胚胎的過程十分復雜，研究人員發現，哺乳動物卵母細胞正常發育過程中存在減數分裂Ⅰ前期雙線期停滯和減數分裂Ⅱ中期停滯，克服這些停滯使卵母細胞恢復減數分裂是至關重要的。哺乳動物卵母細胞減數分裂的恢復需要激活鈣調蛋白Ⅱ從而提高卵母細胞內Ca濃度，卵母細胞內Ca的波動以及胚胎發育的過程中要受到多種基因的調控。劉紅林等研究表明，顯微注射Ca可激活小鼠MⅡ卵母細胞。研究人員發現，1被磷酸化后可以導致細胞內Ca通道開放。1被激活后，水解為磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(phosphatidylinositol(4,5)bisphosphate, PIP2)生成第二信使三磷酸肌醇(inositol phosphate, IP3)及甘油二酯(diglyceride, DAG)，繼而引發細胞內Ca釋放從而將細胞外信息傳遞給下游效應分子，參與動物中配子的形成、受精、細胞增殖、早期發育到細胞分化、分泌、收縮、光感覺等許多生物學反應的調節。研究表明，1可誘導小鼠卵母細胞減數分裂的恢復。Runft等研究發現，1參與海星卵受精時Ca的釋放；在哺乳動物卵子中，1的活性是受精時Ca釋放所必需的。

1是磷脂酶C(phospholipase C, PLC)的一個亞型，胞內Ca的觸發機制與1的激活息息相關，1被激活后可生成IP3和DAG，生成的IP3可激活胞內Ca的釋放機制，而Ca的升高是卵母細胞恢復減數分裂的關鍵，DAG可以直接激活蛋白激酶C，研究表明蛋白激酶C參與了卵母細胞受精過程、卵母細胞減數分裂的恢復和減數分裂Ⅰ和Ⅱ中紡錘體的調控。

本研究利用顯微注射技術將pcDNA3.1-EGFP-1導入MⅡ期卵母細胞中為試驗組，以顯微注射空載體pcDNA3.1-EGFP作為對照組，經48 h 后統計其卵裂率，120 h后統計桑椹胚率；并利用Ca探針Rhod 2-AM監測MⅡ卵母細胞，顯微注射后16、48、72、96、120 h時卵母細胞和早期胚胎體外發育過程各時期Ca波動。這些將為進一步探究1基因對綿羊早期胚胎發育機制的研究奠定基礎，為提高綿羊早期胚胎體外發育能力等方面的研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 重組質粒與卵巢

試驗用重組質粒pcDNA3.1-EGFP-1 和pcDNA3.1-EGFP空載均為石河子大學動物科技學院實驗室所保存；綿羊卵巢(=60)采自石河子市屠宰場。

1.2 主要試劑

HEPES、NaCl、KCl、NaHCO、丙酮酸鈉、谷氨酰胺、石蠟油、必需氨基酸、非必需氨基酸、乳酸鈉、細胞松弛素等試劑均購自美國Sigma公司；HMG購自石河子大學第一附屬醫院；生理鹽水、抗生素均購自藥店；TCM199粉末、FBS購自GIBCO公司；Rhod 2-AM 鈣離子熒光探針購自新疆恒朝生物技術有限公司。

1.3 主要儀器

微量移液器(Eppendorf)；超凈工作臺(Zhjh-1112)；立式高壓滅菌鍋(Zeal-Gr60 da)；二氧化碳培養箱(Thermo)；顯微鏡加熱板(Cryologic)；倒置顯微注射操作儀(Nikon)；激光共聚焦顯微鏡(Nikon)等。

1.4 方法

1.4.1 重組質粒的驗證 對實驗室保存的重組質粒pcDNA3.1-EGFP-1的陽性克隆菌液進行PCR鑒定，根據Primer 5.0設計1(登錄號：NC_040264.1)引物(表1)，菌液PCR鑒定體系：Mix 7.5 μL，ddHO 4.5 μL，上、下游引物各1 μL， 菌液1 μL。將菌液接種于20 mL含抗性LB的液體培養基中活化，37 ℃、180 r·min過夜培養。利用DNA質粒小量提取試劑盒按照說明書提取質粒，將重組質粒pcDNA3.1-EGFP-1雙酶切驗證，雙酶切反應體系20 μL：模板DNA 10.0 μL，ddHO 6.0 μL，1×H Buffer 2.0 μL，d Ⅲ 1.0 μL,I 1.0 μL,并將陽性菌液送至睿博興科公司測序，將鑒定結果正確的陽性菌液接種于含抗性的LB液體培養基，37 ℃、180 r·min過夜培養并按照無內毒素質粒大提試劑盒說明書提取質粒。

1.4.2 綿羊卵母細胞的體外成熟培養 用加入抗生素的生理鹽水(37 ℃預熱)沖洗綿羊卵巢 2～3次， 剔除結締組織后繼續用含抗生素的生理鹽水洗滌2次，將卵巢放入已預熱平衡2 h的割卵液中并用鑷子固定卵巢，用11 cm手術刀將卵巢表面卵泡切開，然后用撿卵針收集割卵液中胞質均勻、包裹卵丘細胞3層及以上的卵丘-卵母細胞復合體(COCs)，取出預熱平衡2 h的成熟液，將挑選好的COCs放入成熟液中清洗3次，然后將其放入成熟液微滴(每個微滴100 μL)中，在溫度為38.5 ℃，5% CO的培養箱中體外成熟培養24 h。

表1 引物序列

1.4.3 綿羊成熟卵母細胞的選擇 在倒置顯微鏡下觀察卵母細胞成熟的情況，未成熟卵母細胞周圍的顆粒細胞沒有向外擴散，并且分布不均勻未分層，成熟卵母細胞周圍的顆粒細胞呈放射狀向外擴散且有分層現象，顆粒細胞吹打干凈后可明顯看到排出第一極體(圖1)。

A.未成熟COCs；B.成熟COCs；C.成熟卵母細胞A. Immature COCs; B. Mature COCs; C.Mature oocyte圖1 卵母細胞成熟情況(40×)Fig.1 Oocytes maturation(40×)

1.4.4 重組質粒卵母細胞內顯微注射 COCs培養24 h后，將卵母細胞在透明質酸酶中作用5 min,并用移液槍反復吹打卵母細胞周圍的顆粒細胞直至將顆粒細胞吹打干凈，隨后用成熟液洗滌3次, 挑選排出第一極體的細胞。將含有第一極體的細胞隨機分為兩組，分別移入操作液的微滴中。

將制備好的固定針、注射針安裝在顯微操作儀上，然后用固定針吸附固定卵母細胞，用注射針吸取重組質粒pcDNA3.1-EGFP-1后，注入卵母細胞胞質內，最后退出注射針，1 h內完成所有卵母細胞的顯微注射操作。對照組卵母細胞顯微注射pcDNA3.1-EGFP空載體，方法同上。將兩組細胞分別放入SoFaa液中，在培養條件為5% CO、溫度38.5 ℃和飽和濕度100%的培養箱中培養。48 h后開始統計卵裂率。

1.4.5 卵母細胞和早期胚胎Ca的測定 分別挑選MⅡ卵母細胞，顯微注射16、48、72、96、120 h的卵母細胞放入PBS緩沖液中清洗3次，以除去培養基。將其放入Rhod 2-AM染色液中，在38.5 ℃，5% CO培養箱中孵育1 h,隨后將其放入胚胎發育液中清洗3次，以除去染色液；最終將各時期細胞分別放入含有胚胎發育液的玻璃培養皿中，利用激光共聚焦顯微鏡觀察Ca的分布情況和熒光強度，對比卵母細胞和早期胚胎各時期的熒光強度并進行分析。

1.5 統計學分析

所有試驗均重復至少3次，采用SPSS21.0統計軟件進行獨立樣本檢驗分析和單因素方差分析，<0.05表示差異顯著，<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 重組質粒的鑒定

對菌液進行PCR鑒定，后將PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測得到大小330 bp的目的條帶(圖2)，與預期相符。將pcDNA3.1-EGFP-1用d Ⅲ和I進行雙酶切，酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測出現兩條清晰可見的條帶：一條為5 428 bp的載體線性片段，另一條為3 960 bp的目的片段(圖3)，其大小與預期相符。將菌液送至睿博興科公司測序，測序結果正確可用于后續顯微注射試驗。

M. DNA相對分子質量標準;1～3. PCR產物;N. 陰性對照M. DNA marker (50-1 031 bp);1-3. The PCR products;N. Negative control圖2 菌液PCR鑒定Fig.2 PCR identification of bacterial solution

M. DNA相對分子質量標準;1、3. 雙酶切產物；N. 陰性對照M.Super marker; 1,3. Double digestion products;N. Negative control圖3 重組質粒雙酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid by double digestion

2.2 卵母細胞顯微注射后的卵裂率及早期胚胎發育情況

結果顯示，兩組卵母細胞內均可觀察到綠色熒光，載體成功在胞內表達。注射pcDNA3.1-EGFP空載體的對照組卵母細胞沒有卵裂現象(圖4)，而注射pcDNA3.1-EGFP-1重組質粒的試驗組卵母細胞發生卵裂(圖5)。

A. 顯微注射pcDNA3.1-EGFP(明場)；B. 顯微注射pcDNA3.1-EGFP(暗場)A. Microinjecting pcDNA3.1-EGFP (open field);B. Microinjecting pcDNA3.1-EGFP (dark field)圖4 顯微注射pcDNA3.1-EGFP卵母細胞發育情況 (100×)Fig.4 Development of microinjected pcDNA3.1-EGFP oocytes (100×)

A. 顯微注射pcDNA3.1-EGFP-PLCγ1(明場);B. 顯微注射pcDNA3.1-EGFP-PLCγ1(暗場)A. Microinjecting pcDNA3.1-EGFP-PLCγ1 (open field);B. Microinjecting pcDNA3.1-EGFP-PLCγ1 (dark field)圖5 顯微注射pcDNA3.1-EGFP-PLCγ1卵母細胞卵裂情況(100×)Fig.5 Cleavage of microinjected pcDNA3.1-EGFP-PLCγ1 oocytes (100×)

2.3 卵母細胞和早期胚胎Ca2+的熒光強度

利用激光共聚焦顯微鏡觀察卵母細胞以及早期胚胎發育不同時期Ca的波動情況(圖6)，結果顯示，1基因可以引起早期胚胎發育過程中Ca振蕩，Ca都主要分布在胞質中，MⅡ卵母細胞Ca熒光強度最低，顯微注射48 h Ca熒光強度最高與MⅡ卵母細胞Ca熒光強度相比，差異極顯著(<0.01)， 隨著胚胎的發育熒光強度開始減弱隨后趨于平穩(圖7)。

圖6 激光共聚焦顯微鏡觀察各時期Ca2+濃度變化(200×)Fig.6 Laser confocal microscopy observation of Ca2+ concentration in each period (200×)

不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)Different capital letters mean very significant difference (P<0.01), different lowercase letters mean significant difference (P<0.05)圖7 顯微注射PLCγ1后各時期Ca2+熒光強度變化Fig.7 Changes of Ca2+ fluorescence intensity in each period injected PLCγ1

顯微注射48 h，在倒置熒光顯微鏡下觀察卵母細胞卵裂情況并進行統計分析(表2)。結果顯示，注射pcDNA3.1-EGFP空載體的對照組的卵裂率為0；而注射pcDNA3.1-EGFP-1重組質粒的試驗組的卵裂率為(19.67±0.2)%，差異極顯著(<0.01)，桑椹胚率為(9.00±0.17)%，差異顯著(<0.05)。

表2 卵母細胞卵裂率和桑椹胚率統計分析

3 討 論

孤雌激活是可以實現無需精子介入的卵母細胞激活分裂和發育，是無性生殖技術的一種，其對研究胚胎發育的機制具有非常重大的意義。為獲得較高的孤雌激活卵裂率和發育率，研究人員不斷深入探索卵母細胞孤雌激活的方法，目前較為優良的孤雌激活方式主要是6D聯合離子霉素激活。卵母細胞激活在胚胎發育過程中起到關鍵作用，研究發現Ca在小鼠卵母細胞激活過程中發揮重要作用，Ca的瞬時升高可以導致小鼠卵母細胞恢復減數分裂從而使其繼續發育到早期胚胎。Yeste等闡明，Ca振蕩在卵母細胞激活過程中發揮重要作用，維持其在卵母細胞內穩態的機制至關重要，IP3與三磷酸肌醇受體(inositol 1,4,5-trisphosphate receptors, IP3R)結合后導致鈣離子通道打開，從而使Ca從內質網釋放，體細胞中IP3R的活性受到其他激酶蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)和磷酸蛋白PP1、PP2A及鈣調素的調控，IP3R在哺乳動物卵母細胞中的調控機制仍有待確定。哺乳動物精卵結合后鈣離子濃度升高主要是由于精子通過與G蛋白偶聯的受體作用從而激活磷脂酶C，PLC可水解PIP，產生IP3和DAG；IP3一旦產生可使內質網上儲存的Ca釋放進入胞質，釋放出來的Ca又可以反過來激活PLC而增加IP3的產量從而形成鈣波；DAG刺激蛋白激酶C的活性從而使PKC的底物蛋白磷酸化,導致卵母細胞激活,恢復減數分裂。1基因作為磷脂酶C的一個亞型，其含有SH2和SH3兩個主要結構域，這兩個結構域可使1基因參與小鼠卵母細胞的激活。

本研究通過顯微注射技術將1基因導入綿羊MⅡ期卵母細胞，結果表明1基因可以使卵母細胞發生Ca振蕩，使Ca濃度瞬時升高,激活綿羊卵母細胞并使其繼續發育到桑椹胚，卵裂率為(19.67±0.2)%，桑椹胚率為(9.00±0.17)%,與對照組顯微注射空載體pcDNA3.1-EGFP相比差異顯著。哺乳動物卵母細胞在發育過程中會經歷兩次停滯期，在卵泡中的卵母細胞在第一次減數分裂的前期受阻，排出卵泡的卵母細胞會恢復第一次減數分裂，在大多數情況下恢復第一次減數分裂的卵母細胞會在第二次減數分裂再次停滯。然而,卵母細胞無論是通過受精還是孤雌激活都會引起胞內Ca振蕩，誘導卵母細胞減數分裂的恢復從而使其發育成胚胎。研究表明，當激活胞內PLC1信號后，胞內Ca濃度會升高。Sette等發現,1基因參與小鼠卵母細胞恢復減數分裂的過程，1被激活后觸發小鼠卵母細胞Ca釋放機制從而使卵母細胞恢復減數分裂。研究表明,1可催化PIP2生成DAG和IP3，IP3可使細胞內Ca釋放，若細胞內1基因缺失，細胞內Ca濃度較低且峰值出現較晚。本研究表明，顯微注射1基因48 h后引起胞內Ca濃度升高，這可能與1可水解PIP2生成IP3有關。研究發現，1基因可以通過調控PTK-1信號通路激活毛翼蟲卵子；1抑制劑U73122可以阻止孤雌生殖卵子的激活。因此，在MⅡ期導入1基因后可導致綿羊卵母細胞發生Ca振蕩從而使綿羊卵母細胞發生卵裂。但1基因調控綿羊卵母細胞發育以及胞內Ca振蕩的機制還需進一步研究。

4 結 論

綜上所述，本研究發現1基因可以通過提高綿羊卵母細胞內Ca濃度誘導卵母細胞恢復減數分裂，使其發生卵裂并可繼續發育到桑椹胚。