青蒿提取物治療兔球蟲病效果評價

王麗坤，金振華，張國華，張 備，鹿凌巖，郝彩虹，劉珈羽，田秋豐

（黑龍江省農業科學院畜牧獸醫分院，黑龍江齊齊哈爾 161005）

兔球蟲病是對兔養殖業危害最嚴重的寄生蟲疾病之一，一年四季均可發生[1]，各年齡段均易感，斷奶至4 月齡的幼兔尤為易感[2]。兔球蟲病一旦暴發，常危及整個兔養殖場，對養兔業造成巨大的經濟損失。兔球蟲的生活史包括孢子生殖、裂殖生殖和配子生殖等3個階段[3]，其中孢子生殖過程通常在宿主體外進行，裂殖生殖和配子生殖則于宿主細胞內完成，兔經口感染孢子化的球蟲卵囊而發病[4]。兔球蟲病的防治長期依賴化學類藥物和抗生素類藥物，進而引發耐藥性和藥物殘留問題[5]。中藥因毒副作用小、不易產生耐藥性等特點有望成為防治兔球蟲病的新選擇。

我國古代的中藥學著作《神農本草經》中記載，青蒿具有良好的抗菌、殺蟲作用[6]。青蒿屬菊科植物中的黃花蒿種屬，其主要有效成分青蒿素在國際上獲得了極大的認可，具有抗球蟲、抗菌和免疫調節等作用[7-8]。青蒿提取物對兔球蟲卵囊體外孢子化具有較好的抑制作用，且隨著藥物濃度的增高，卵囊孢子化呈下降趨勢，但無法殺滅兔球蟲卵囊[9]。有研究表明，日糧中添加青蒿花枝干粉治療兔球蟲病可產生與地克珠利相似的治療效果，且未出現球蟲感染強度反彈，還可顯著促進動物體增重，降低飼料的成本[10]。本研究利用超聲波提取法提取青蒿有效成分，以商品化妥曲珠利為對照，評價青蒿提取物治療兔球蟲病的治療效果，以期為兔球蟲病的防治提供新方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

1～2 月齡的健康幼兔購自齊齊哈爾種兔場，通過糞便檢查篩選未感染兔球蟲幼兔30只作為試驗動物，在已消毒環境下飼養1 w。

1.1.2 兔球蟲卵囊

兔球蟲卵囊分離自大慶市龍鳳區某兔場，采集已人工感染球蟲的兔糞樣置于容器，應用飽和鹽水漂浮法收取上液置于離心管；6 000 r/min 離心5 min，沉淀物放入含有2.5%重鉻酸鉀溶液的平皿，25 ℃溫箱中孵育72 h，孢子化的卵囊保存于4 ℃冰箱。

1.1.3 試驗試劑

青蒿購自黑龍江省康復藥材有限責任公司。妥曲珠利混懸液（批號：KPOAL 4L）為拜耳（四川）動物保健有限公司生產。其他試劑均為分析純。

1.1.4 試驗儀器

分析天平（上海梅特勒-托利多有限公司）、恒溫超聲提取機（北京弘祥隆生物技術開發有限公司）、低速離心機（上海安亭科學儀器廠）、旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）、生物顯微鏡（上海尼康儀器有限公司）；載玻片、蓋玻片等。

1.2 試驗方法

1.2.1 青蒿有效成分的提取

稱取一定量青蒿粉末，按照料液比1∶50 g/mL 加入無水乙醇，將料液放入恒溫超聲提取機。設置超聲波強度120 W、溫度50 ℃、超聲5 s、間歇5 s、超聲時間30 min。5 000 r/min 離心10 min，0.45 μm 濾膜過濾，藥液采用旋轉蒸發儀進行濃縮后保存。

1.2.2 試驗設計

將幼兔隨機分為6組，每組5只，各組均在同一條件下分籠飼養。設置空白對照組（不感染不用藥）、感染不用藥對照組；青蒿提取物低劑量組、中劑量組和高劑量組，每只幼兔分別按照每日每kg體重喂服5、10、15 g青蒿粉末提取后的濃縮物；妥曲珠利組每只幼兔按照每日每kg體重喂服托曲珠利0.4 mL。

1.2.3 球蟲卵囊人工感染

各感染組幼兔均人工感染孢子化兔球蟲卵囊5×104個/只，各用藥組均于感染當日開始用藥，感染后第15 d撲殺剖檢。

1.2.4 球蟲卵囊計數

分別在人工感染球蟲卵囊第0、5、10、15 d收集各組試驗兔糞便，取2 g 新鮮糞便置于干凈的100 mL 燒杯內，加入8 mL飽和食鹽水，玻璃棒搗碎混勻；再加入50 mL飽和食鹽水混勻，60目篩網過濾，吸取濾液充滿2個計數室；顯微鏡載物臺上靜置3～5 min，在10倍物鏡下鏡檢計數，分別查完2 個計數室100 個方格內的卵囊數量n1和n2，計算每克糞便中卵囊數量（OPG值）。

式中：2表示2個計數室；0.15表示計數室內每個方格的體積；60表示糞便過濾篩的目數；2表示糞便重量2 g。

卵囊比數為0～1% 時，卵囊值為0；卵囊比數為2%～25%時，卵囊值為5；卵囊比數為26%～50%時，卵囊值為10；51%～75% 時，卵囊值為20；卵囊比數為76%～100%時，卵囊值為40。

1.2.5 相對增重率與存活率

所有健康幼兔在試驗前稱重記錄，撲殺前稱重記錄。試驗期間，記錄各組幼兔死亡情況，對死亡的幼兔及時剖檢，確定死亡原因。

1.2.6 腸道病變計分

評分標準：0分：腸道中無眼觀異常；1分：小腸充血，黏膜稍增厚、呈淡黃色；2分：小腸充血，黏膜肥厚、充血，黏膜面有少量白色小結節，黏液增多，呈桃紅色；3分：小腸高度充血，黏膜肥厚，黏膜彌散大量小白結節，腸腔內黏液黏稠，呈黃紅色；4分：空腸、回腸腫脹，黏膜呈腦回狀，腸腔內充滿橙黃色黏液塊或麩皮狀物，黏膜上密布小結節或結節斑，部分黏膜脫落。

1.2.7 抗球蟲指數（ACI）

按照美國默克公司方法，ACI＜120表示藥物對球蟲無效；120＜ACI＜160 表示低效藥物；160＜ACI＜180 表示中等效力的抗球蟲藥物；ACI＞180表示高效抗球蟲藥。

1.3 數據統計與分析

試驗數據采用SPSS 19.0 統計學軟件進行整理分析，采用X2檢驗比較。P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 各組不同時間球蟲OPG值變化情況（見表1）

由表1可知，試驗第5、10、15 d，各感染組OPG值均顯著高于空白的對照組（P＜0.05），表明感染成功。試驗第5、10、15 d，各用藥組幼兔糞便中兔球蟲卵囊數均顯著低于感染不用藥對照組（P＜0.05），表明各用藥組的藥物均具有一定的抗球蟲作用。

表1 各組不同時間球蟲OPG值變化情況Tab.1 Changes of OPG value of coccidia at different time in each group單位：×104

各青蒿提取物組幼兔糞便中兔球蟲卵囊數隨著藥物用量的增加，幼兔糞便中兔球蟲卵囊數明顯降低；經過數據分析，試驗第15 d 時，青蒿提取物高劑量組與妥曲珠利組在幼兔糞便中的兔球蟲卵囊數差異不顯著（P＞0.05），但顯著低于其他用藥組（P＜0.05）；結果表明，青蒿提取物中劑量組和低劑量組的抗球蟲效果較差。

2.2 各組治療效果總體評價（見表2）

由表2可知，各用藥組用藥后，通過卵囊值、增重情況、存活情況和腸道病變情況綜合評價藥物對兔球蟲病的治療效果。結果顯示，青蒿提取物高劑量組和妥曲珠利組的ACI 均大于180，青蒿提取物中劑量組和青蒿提取物低劑量組的ACI 分別為178 和149；表明高劑量青蒿提取物和妥曲珠利為高效抗球蟲藥物，中劑量和低劑量的青蒿提取物分別為中等效力和低等效力的抗球蟲藥。

表2 各組治療效果總體評價Tab.2 Overall evaluation of treatment effect in each group

3 討論

兔球蟲病主要危害兔的肝臟和盲腸。兔球蟲的蟲體寄生于肝臟，造成部分肝細胞變性和壞死，影響肝臟的消化吸收和解毒功能；蟲體寄生于腸內，則破壞腸黏膜上皮細胞，使黏膜上皮細胞大量變性壞死、崩解，成為有毒物質，使機體發生自體中毒，進而導致死亡[12]。青蒿性苦、寒，入肝、膽經，苦寒不傷胃，能夠宣化胃腸濕熱，而上述功效主要歸功于青蒿的主要成分青蒿素，可針對肝臟、腸道球蟲發揮抑制作用。此外，青蒿素還可以緩解機體炎性反應，具有對機體進行免疫調節的功效[13]，從而對兔球蟲病起到標本兼治的目的。因此，青蒿提取物可作為化學類抗球蟲藥物的替代藥物，應用于兔球蟲病治療。

與妥曲珠利等化學類藥物相比，青蒿提取物能夠更為安全、經濟、有效地防治兔球蟲病。2015 年的《中國藥典》中記載，青蒿具有清虛熱、除骨蒸、解暑熱、截瘧、退黃的功效。青蒿應用于兔球蟲治療可以解決化學藥物造成的耐藥性以及藥物殘留的問題，緩解環境污染，提高生物安全。本研究中，高劑量使用青蒿提取物可產生與妥曲珠利相近的治療效果；且青蒿為草本類植物，屬菊科[14]，種類繁多，分布廣泛，一般產量較高、成本低，易購買或采集。因此，研究開發青蒿有效成分提取方法及其提取物功效，對青蒿素人工合成技術的改進或研發與青蒿素具有協同作用的某些藥物的復方制劑，在球蟲病的防治方面具有良好的應用前景[15]。

本研究采用超聲波提取方法提取青蒿的有效成分，不僅克服了傳統的煎煮法有效成分提取不充分、提取時間長和高溫易破壞青蒿有效成分等弊端，而且該方法對儀器設備要求不高，適用于基層養殖場。本研究提供了一種方便、安全、環保、高效治療兔球蟲病的新方法，根據中獸醫辯證理論，進一步研發質優價廉、高效低毒、工藝簡單、使用方便的中藥組方制劑，為兔球蟲病的防治及養兔業的健康發展提供參考。

4 結論

試驗結果表明，在感染后5 d內，感染不用藥組幼兔糞便中兔球蟲卵囊數與其他組相比雖存在差異，但不顯著；感染第5～10 d后，感染不用藥組幼兔兔球蟲卵囊數明顯增多；感染第10 d，其他各用藥組幼兔糞便中的兔球蟲卵囊數明顯減少，說明藥物在第5 d后開始發揮作用效果。

綜上所述，給予幼兔高劑量的青蒿提取物具有較好的治療效果，用藥后第15 d，幼兔的癥狀已完全消失，幼兔糞便中的兔球蟲卵囊數明顯得到控制，且高劑量的青蒿提取物能夠促進兔進食，提高相對增重率，腸道病變減輕，故使用青蒿提取物高劑量可有效抑制兔球蟲病暴發，相對應用妥曲珠利組治療效果更好。