內(nèi)窺鏡在鴯鹋真菌性氣管炎疾病診斷中的應(yīng)用

朱云蕓，胥 哲，焦思敏，羅 毅，丁 楠，普天春*，劉秉祺

（1. 北京動物園，北京 100044 ； 2. 遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧沈陽 110032）

禽真菌性氣管炎、真菌性肺炎是禽類常見疾病之一。在圈養(yǎng)條件下，禽類自生活環(huán)境中吸入大量真菌孢子以及動物機體免疫力下降是導致真菌侵襲主要誘因。在圈養(yǎng)動物飼養(yǎng)管理工作中，疾病診斷是重要的組成部分；對珍稀野生禽類真菌性氣管炎、肺炎進行診斷，盡可能快速地取材確診避免禽類應(yīng)激，是更值得被關(guān)注的問題。

禽類呼吸系統(tǒng)真菌感染的關(guān)注點多為家禽養(yǎng)殖，有關(guān)圈養(yǎng)野生珍禽的研究則多集中于對癥治療及剖檢，內(nèi)窺鏡應(yīng)用于圈養(yǎng)珍禽的真菌性呼吸道疾病鮮少報道。本文記錄了對北京動物園圈養(yǎng)鴯鹋進行內(nèi)窺鏡氣管檢查及窺鏡引導下活檢，取氣管膜附著物，并通過真菌培養(yǎng)、基因測序，對該病例進行診斷；經(jīng)檢查確診為熱帶念珠菌及阿薩希絲孢酵母菌混合感染的氣管炎。文章以氣管膜附著物的技術(shù)應(yīng)用為例，對該病例的診斷治療進行分析，以期為珍惜禽類真菌性氣管炎肺炎相關(guān)呼吸道感染提供診斷方案，提升相關(guān)疾病的治愈率。

1 病例資料

病例為北京動物園內(nèi)圈養(yǎng)鴯鹋，雌性，體重30 kg，5 歲；消瘦、咳喘、拒食。經(jīng)臨床獸醫(yī)治療，采用恩諾沙星2.2 mg/kg肌肉注射7 d[1]，未見顯著變化，站立逐漸困難，胸部影像學檢查未見明顯病變。

為明確診斷，防止疾病加重，需進一步在麻醉狀態(tài)下進行氣管內(nèi)檢查，在內(nèi)窺鏡引導下取樣，進行真菌培養(yǎng)，樣本進行ITS基因測序。

2 檢查結(jié)果

2.1 真菌分離培養(yǎng)及鑒定（見圖1～圖4）

鴯鹋麻醉前禁食禁水10 h，吸入麻醉。麻醉平穩(wěn)后，持氣管鏡探入鴯鹋氣管內(nèi)觀察氣管內(nèi)壁，并在窺鏡引導下使用纖支氣管活檢鉗采樣。鴯鹋蘇醒后未見不良反應(yīng)。

將采集到的樣品置于無菌試管，2 h 內(nèi)送至實驗室化驗。樣品加入1 mL滅菌水，3 000 r/min離心5 min，取沉淀物接種于DTM培養(yǎng)基內(nèi)[2]，25 ℃培養(yǎng)1周，觀察培養(yǎng)結(jié)果。所用培養(yǎng)基購自北京索萊寶科技有限公司。

DTM 培養(yǎng)基可見兩種真菌菌落生長，編號命名為菌1、菌2。菌1 革蘭氏染色鏡檢結(jié)果、培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)見圖1、圖2；菌2革蘭氏染色鏡檢結(jié)果、培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)見圖3、圖4。

由圖1、圖2可知，菌1顯微鏡下觀察呈短桿狀，單個或雙個成串，為革蘭氏陽性菌；菌落呈乳黃色，隨菌落生長，菌落邊緣呈褶皺狀花瓣狀。

圖1 菌1革蘭氏染色鏡檢結(jié)果Fig.1 Gram stain microscopy result of bacterial 1

圖2 菌1的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of bacteria 1

由圖3、圖4 可知，菌2 顯微鏡下觀察呈著色不均的圓形或卵圓形，為革蘭氏陽性菌；菌落呈乳白色，直徑為2 mm，為凸起無光澤圓形菌落。

圖3 菌2革蘭氏染色鏡檢結(jié)果Fig.3 Gram stain microscopy result of bacterial 2

圖4 菌2在DTM培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.4 Colony morphology of bacteria 2

2.2 測序結(jié)果（見圖5、圖6）

兩分離菌株經(jīng)中瑞動檢（北京）生物技術(shù)有限公司基因測序，結(jié)果通過Gen Bank進行Blast對比，相似度均達到99%。由圖5、圖6 可知，菌1 為阿薩希絲孢酵母菌，菌2 為熱帶念珠菌。

圖5 阿薩希絲孢酵母菌部分序列Fig.5 Partial sequence of Trichospora asahi

圖6 熱帶念珠菌部分序列Fig.6 Partial sequence of Candida tropicalis

2.3 診斷結(jié)果

經(jīng)真菌培養(yǎng)、ITS基因測序，患病鴯鹋氣管內(nèi)白色附著物及主支氣管樣本為熱帶念珠菌及阿薩希絲孢酵母菌，診斷為兩種真菌混合感染的氣管炎。由于真菌斑塊長期附著，患病鴯鹋氣管膜可見點狀出血。

3 治療

3.1 用藥方案

根據(jù)診斷結(jié)果，患病鴯鹋采用抗真菌藥物聯(lián)合用藥，并配合霧化進行治療。口服伏立康唑20 mg/kg，連續(xù)服用21 d；口服伊曲康唑8 mg/kg，連續(xù)服用14 d[1]。F10（主要成分為季銨鹽和雙胍類兩性表面螯合劑）加滅菌水，按照1∶250 的比例稀釋，取20 mL 進行霧化治療，每次20 min，每日1 次，連續(xù)10 d[1,3]。使用F10 加滅菌水按相同比例稀釋，取1 mL 對患病鴯鹋進行氣管注射，連續(xù)3 d[3]。經(jīng)治療，患病鴯鹋康復。

3.2 獸舍消毒

該鴯鹋臨近獸舍環(huán)境噴灑消毒，更換鋪設(shè)墊料，F(xiàn)10消毒劑按1∶500稀釋對鴯鹋獸舍環(huán)境每日噴灑消毒。冬季保證獸舍內(nèi)溫度不出現(xiàn)大幅度波動；日糧中合理補充蛋白質(zhì)，增加營養(yǎng)攝入。夏季高溫多雨，獸舍內(nèi)增加通風，更換室內(nèi)墊料。更換墊料時為避免出現(xiàn)吸入真菌孢子的風險，應(yīng)先將鳥類移出[4-5]。日常應(yīng)保證動物在室外的活動時長[5]。此外，水盆與食盆也應(yīng)使用F10消毒劑，稀釋后每日浸泡消毒[3]。

4 討論

熱帶念珠菌是重要的念珠菌血癥和播散性念珠菌病的病原菌[2]，在一定條件下定植于呼吸道、肺部、胃腸道等處[6]。念珠菌的主要致病因素為機體抵抗力降低或長期使用廣譜抗生素[7-8]，其他因素包括老齡、營養(yǎng)不良、環(huán)境清潔度等。熱帶念珠菌是侵襲性真菌病的主要致病菌，可表現(xiàn)出較強的毒力[9-11]；熱帶念珠菌易形成生物膜[12]，具較強的附著性，導致獸舍消毒易殘留、患病動物易反復感染或傳染同獸舍內(nèi)其他動物[9,13]。

2022年，國內(nèi)人類臨床醫(yī)學報道了首例散播性絲孢酵母菌病[14]，表明阿薩希絲孢酵母菌可引起淺部感染如白毛結(jié)節(jié)病，還可導致深部侵襲性感染[15-16]，發(fā)病率呈明顯上升趨勢，且臨床表現(xiàn)多樣化[13,15-16]。阿薩希絲孢酵母菌致病力較強，感染常見于長期使用廣譜抗菌藥導致菌群紊亂或免疫功能下降，可引起侵襲性肺部感染導致呼吸衰竭預后差，病死率高[14,17]。有研究表明，聯(lián)合用藥在治療絲孢酵母菌病方面具有重要的意義[14,17-18]。

本文治療過程中，真菌培養(yǎng)所需化驗時間較長。而動物治療時間寶貴，故在日常臨床診療中，若對某種疾病高度懷疑，得出明確診斷結(jié)果前先進行對癥治療可為動物提供寶貴的后續(xù)治療時機[3]。如本文中患病鴯鹋呼吸困難等癥狀緩解后，采取長期口服真菌藥物的治療方案；直至再次臨床檢查時，培養(yǎng)結(jié)果為陰性。

在禽類臨床用藥中，伊曲康唑的生物利用度有限，且因該藥物具有肝毒性副作用，用藥的患病動物應(yīng)每月進行血清生化檢查[1,19]。伏立康唑是較新的抗真菌藥物，對禽類安全且對真菌感染的治療效果較好[3]。有研究表明，聯(lián)合用藥可提高治療效果，降低真菌耐藥性的產(chǎn)生[14,17-18]。對于深部侵入型真菌感染應(yīng)繼續(xù)治療2～3 月[20-21]，在治療初期，患病動物自身抵抗力降低，動物出現(xiàn)真菌感染，影響患病動物的肺部與支氣管局部組織的功能，使病情逐漸惡化，此時應(yīng)提供支持性護理，包括輸液、強制喂食、管飼等[3]。

內(nèi)窺鏡進行氣管內(nèi)觀察及采樣，是確診禽類呼吸道真菌感染的必要診斷步驟[1]。對胸部影像學無明顯病變特征的咳喘病例，應(yīng)及時進行病原學和支氣管鏡檢查，氣管上出現(xiàn)的斑塊及氣管深部采樣的鑒定結(jié)果可保證診斷的準確性，對明確診斷具有重要意義[22]。

5 結(jié)論

本文在內(nèi)窺鏡引導下于氣管深部采集氣管膜附著物，結(jié)合樣本的真菌培養(yǎng)測序等檢查，對鴯鹋進行了明確診斷，確定患有兩種真菌混合感染的真菌性氣管炎。同時，本研究也是首次從動物園內(nèi)圈養(yǎng)禽類氣管內(nèi)采樣分離得到阿薩希絲孢酵母菌。該病例的診斷與治療可為今后野生動物臨床診療提供參考。