堿性蛋白酶酶解豆粕及對其品質(zhì)改善的研究

周宇朦，孫洪浩，呂福軍

（遼寧波爾萊特農(nóng)牧實業(yè)有限公司，遼寧沈陽 110122）

豆粕是大豆提取豆油后的殘渣再加工得到的副產(chǎn)品[1]，是飼料行業(yè)中使用較多的一種優(yōu)質(zhì)植物性蛋白飼料源[2]。豆粕富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，蛋白質(zhì)含量高，氨基酸組成平衡[3]。但豆粕中抗營養(yǎng)因子種類較多，抗營養(yǎng)因子蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)大于40%，結(jié)構(gòu)緊密，不易消化[4-6]。豆粕中的抗原蛋白是指會引發(fā)動物產(chǎn)生過敏反應(yīng)的大分子蛋白[7]，如β-伴球蛋白（42～53、58～77、58～83 kDa）和大豆球蛋白（18～20、31～45 kDa）[8]等，降低了畜禽生產(chǎn)性能和飼料利用率，在很大程度上限制了豆粕在飼料生產(chǎn)中的應(yīng)用[8]。

近年來，隨著有關(guān)酶制劑應(yīng)用的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)豆粕經(jīng)體外酶解可提高其消化利用率并改善動物的生產(chǎn)性能。其中蛋白酶是蛋白質(zhì)代謝過程中重要的消化酶，能夠催化分解肽鍵，將大分子蛋白降解成小分子蛋白、小肽、氨基酸等，提高蛋白質(zhì)的利用率和飼料利用率[9]。蛋白質(zhì)酶解是一個復(fù)雜的過程，受多種因素影響，如蛋白質(zhì)種類、酶的種類、酶解條件（料液比、酶解pH 值、酶解溫度、酶解時間）和酶滅活條件[10]。蛋白質(zhì)種類和酶的種類是影響酶解產(chǎn)物組成的重要因素，不同的蛋白酶具有不同的酶切位點，可導(dǎo)致酶解產(chǎn)物氨基酸組成、肽的結(jié)構(gòu)和肽分子量的差別[11]。本文使用5 種不同的堿性蛋白酶對豆粕進行酶解，探究不同堿性蛋白酶酶解對豆粕品質(zhì)的影響，從而為準確使用各種堿性蛋白酶提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所使用的豆粕為市售。5種堿性蛋白酶購自多個廠家，分別命名為A、B、C、D、E。氫氧化鈉、濃硫酸、甲醛等均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗儀器

CP2102 電子天平（常州奧豪斯儀器有限公司）、GSP-9080MBE隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）、FiveEasy Plus pH 計（上海梅特勒-托力多儀器有限公司）、HJ-6A數(shù)顯恒溫磁力加熱攪拌器（常州金壇良友儀器有限公司）、KDN-815 全自動凱氏定氮儀（山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司）、Mini-PROTEAN?Tetra System 電泳儀（BIO-RAD）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

將適量的豆粕放入錐形瓶中，加入堿性蛋白酶（200 U/g），按照料水比1∶1加入蒸餾水，混合物攪拌均勻，置于40 ℃培養(yǎng)箱中酶解48 h。酶解結(jié)束后將酶解樣品于85 ℃烘干。

1.3.2 感官評價

參照陳思等[12]的方法，在正常光線及無任何異味的環(huán)境下，取適量豆粕酶解樣品于干凈的托盤中，通過目測評定顏色、鼻嗅評定氣味、手感評定質(zhì)地，酶解豆粕感官評價標準見表1。

1.3.3 pH值的測定

取各個豆粕酶解樣品5 g，加蒸餾水50 mL，磁力攪拌20 min，離心，測上清液pH值。

1.3.4 干物質(zhì)含量的測定

采用常壓干燥法測定干物質(zhì)含量[13]，100 ℃干燥至反復(fù)稱量至恒重。

1.3.5 蛋白水解度的測定

采用甲醛滴定法測定蛋白水解度[14]。此方法基于甲醛與游離氨基結(jié)合，可形成-NH-CH2OH、-N(CH2-OH)2等羥甲基衍生物，導(dǎo)致-NH3+上的氫離子（H+）游離。堿滴定-NH3+放出的H+，測出氨基氮，計算游離氨基的含量[13]，并計算水解度（degree of hydrolysis，DH）。

1.3.6 小肽含量的測定

采用QB/HHS JC006—2013三氯乙酸法測定。

1.3.7 豆粕中抗原蛋白的測定

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPACE）法測定豆粕中抗原蛋白[15]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel軟件進行記錄和統(tǒng)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶酶解對豆粕感官的影響（見表2）

在一定量的豆粕中加入相同酶活的不同種堿性蛋白酶，40 ℃酶解48 h后，評價各個樣品的感官特點。

由表2可知，豆粕經(jīng)過酶解后，顏色稍深，氣味變重，質(zhì)地變水潤黏稠。其次，雖然各個豆粕樣品中添加的堿性蛋白酶不同，但是酶解后感官變化相似。

表2 不同蛋白酶酶解對豆粕感官的影響Tab.2 Effect of different protease enzymatic hydrolysis on soybean meal單位：分

2.2 不同蛋白酶酶解對豆粕pH值的影響（見表3）

由表3 可知，豆粕原料的pH 值為6.51，被不同的堿性蛋白酶酶解48 h 后，pH 值均下降，分別下降了2.23、2.32、2.30、2.27和2.28，下降程度相似，平均下降了2.28倍。

表3 不同蛋白酶酶解對豆粕pH值的影響Tab.3 Effect of different protease hydrolysis on pH value of soybean meal

2.3 不同蛋白酶酶解對豆粕干物質(zhì)含量的影響（見表4）

由表4可知，豆粕原料的干物質(zhì)含量為125.00 g，被不同的堿性蛋白酶酶解48 h 后，干物質(zhì)含量均減少，分別減少10.38、14.15、11.33、14.61 和12.96 g，減少程度相似，平均減少了0.1倍。

表4 不同蛋白酶酶解對豆粕干物質(zhì)含量的影響Tab.4 Effect of different protease hydrolysis on dry matter content of soybean meal 單位：g

2.4 不同蛋白酶酶解對豆粕蛋白水解度的影響（見表5）

由表5可知，豆粕原料的水解度為2.17%，被不同的堿性蛋白酶酶解48 h 后，水解度均增加，分別增加4.61%、4.84%、4.79%、3.87%和3.18%，增加程度相似，平均增加了0.43倍。

表5 不同蛋白酶酶解對豆粕蛋白水解度的影響Tab.5 Effect of different protease hydrolysis on soybean meal protein hydrolysis degree 單位：%

2.5 不同蛋白酶酶解對豆粕小肽含量的影響（見表6）

由表6可知，豆粕原料的小肽含量為4.06%，被不同的堿性蛋白酶酶解48 h 后，小肽含量均增加，分別增加307.39%、246.06%、103.45%、164.79%和126.11%。其中酶A酶解樣品后小肽最多，酶C最少。

表6 不同蛋白酶酶解對豆粕小肽含量的影響Tab.6 Effect of different proteases on the content of small peptides in soybean meal 單位：%

2.6 不同蛋白酶酶解對豆粕抗原蛋白的影響（見圖1）

圖1 不同蛋白酶酶解對豆粕抗原蛋白的影響Fig.1 Effect of different protease enzymolysis on antigen proteins of soybean meal

由圖1可知，豆粕原料中含有大量β-伴球蛋白和大豆球蛋白，被不同的堿性蛋白酶酶解48 h 后，抗原蛋白被大量降解，僅有加酶E的樣品中殘留少量β-伴球蛋白。

3 討論

豆粕是優(yōu)質(zhì)的飼料植物蛋白質(zhì)來源之一[16]，存在不易消化利用等問題，需要借助酶制劑解決。本研究使用5種不同的堿性蛋白酶分別對豆粕進行酶解試驗，結(jié)果顯示，酶解結(jié)束后，各豆粕樣品的感官變化相似，說明堿性蛋白酶種類對感官變化無明顯影響。

酶解結(jié)束后，樣品pH 值下降，原因可能是菌體繁殖，產(chǎn)生有機酸類物質(zhì)[17]，可以提高飼料的適口性[18]。pH值對酶解反應(yīng)產(chǎn)生影響的因素很多。堿性蛋白酶的空間構(gòu)型在不適合的酸堿環(huán)境中會發(fā)生改變，受到可逆或者不可逆的破壞，導(dǎo)致失去酶活力[19]，影響酶的作用。pH值的變化還會影響底物與酶的解離狀態(tài)，影響蛋白質(zhì)的水解程度[20]。但在本試驗中，各個樣品水解度均有所增加，表明為正向影響。

豆粕經(jīng)過酶解后，干物質(zhì)含量減少，小肽和蛋白水解度增加，利用蛋白酶將大分子蛋白分解成小分子物質(zhì)[21]，如寡肽、小肽和游離氨基酸，易被腸胃道吸收，進而提高消化利用率[22]。豆粕中存在較多的抗營養(yǎng)因子，其中抗原蛋白的危害最為嚴重，可引起仔豬發(fā)生過敏性腹瀉、腸黏膜細胞增生等一系列不良反應(yīng)，甚至造成死亡[23-24]。抗原含量高低是評判豆粕品質(zhì)的一項重要指標[25]。本試驗中，大部分抗原被降解，豆粕品質(zhì)得到有效提升。豆粕經(jīng)過酶解后，具有抗營養(yǎng)因子明顯降低、常規(guī)營養(yǎng)成分得到改善、富含多種活性因子、適口性好、抗菌能力強等營養(yǎng)特性[13]。

4 結(jié)論

本試驗以豆粕為原料，探究不同堿性蛋白酶酶解豆粕對其品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，除小肽含量變化差異大外，其他變化相似；酶解后樣品氣味變重，質(zhì)地水潤黏稠，pH值和干物質(zhì)含量下降，蛋白水解度和小肽含量增加，抗原蛋白幾乎全部被降解。綜上所述，酶解后的豆粕品質(zhì)得到有效改善，可選用適宜的堿性蛋白酶對豆粕進行降解，為豆粕高值化利用提供幫助。