氟通過ROS 對HepG2 細胞氧化損傷的影響

陳 瑜，李創(chuàng)業(yè)，魏筱萱，王雨露，田二杰，周變?nèi)A

（河南科技大學動物科技學院，河南洛陽 471023）

氟化物是一種廣泛存在于自然界中的環(huán)境污染物，過量的氟暴露可導致全身多器官組織損傷[1-3]。氟中毒可引起機體細胞內(nèi)DNA損傷和線粒體功能障礙[4]，在眾多的氟中毒機制中，氧化應激機制受到越來越多的關注。細胞受到外界刺激引起氧化應激時，細胞內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧（ROS）[5]；為阻止氧化損傷進一步加劇，細胞會采取提升胞內(nèi)抗氧化酶活性的方式激活一系列的防御措施，對抗過氧化損傷。ROS 主要由線粒體產(chǎn)生[6]，線粒體不僅能夠通過產(chǎn)生ATP 為細胞供能，還可參與細胞衰老和死亡的調控。線粒體內(nèi)膜上存在大量酶，負擔細胞內(nèi)更多的生化反應；ROS 與胞內(nèi)脂質、蛋白質相互作用，可促進細胞膜流動性的降低和膜結構的破壞[7]，影響線粒體功能。

受環(huán)境污染影響，動物尤其是老年動物肝癌的發(fā)病率呈升高趨勢[8-10]。HepG2 細胞是一種經(jīng)典的細胞株，廣泛應用于肝細胞損傷作用機制的研究[11-12]。由于動物種屬存在差異，加之目前尚無穩(wěn)定的動物肝細胞株，故本文采用HepG2 細胞，研究氟致HepG2 細胞氧化損傷的分子機制，為動物氟中毒的作用機制的闡述提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗細胞

人肝癌細胞HepG2購自中國科學院細胞庫。

1.1.2 主要試劑

NaF（純度≥98.0%，西隴化工股份有限公司）；11995 DMEM 高糖培養(yǎng)基、P1400 青鏈霉素混合液（100×）、T1300 胰蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司）；80230-6412胎牛血清（浙江天航生物科技股份有限公司）；S0033S ROS、C2006 MMP 線粒體膜電位檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；A006-2-1 還原型谷胱甘肽（GSH）、A005-1-1 谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、A020-2-2 乳酸脫氫酶（LDH）和H545-1-1 谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.1.3 主要儀器

Infinite M Nano酶標儀（上海帝肯貿(mào)易有限公司）、311直熱型CO2培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技公司）、CKX41倒置顯微鏡（奧林巴斯株式會社）、Axio Observer.A1 倒置熒光顯微鏡（上海蔡司光學儀器國際貿(mào)易有限公司）、BD Accuri C6流式細胞儀（BD生物公司）、DDW-HW138超低溫冰箱（中科美菱低溫科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞模型的建立

根據(jù)氟暴露HepG2 細胞48 h 的半抑制濃度（IC50值）3.76 mmol/L，選擇0、1.88、2.51 和3.76 mmol/L 等4 個氟暴露濃度作為試驗分組。待細胞貼壁后，更換含氟離子（F-）濃度為0、1.88、2.51和3.76 mmol/L的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收獲細胞，分別命名為對照組、1.88 mmol/L F-組、2.51 mmol/L F-組和3.76 mmol/L F-組。

1.2.2 HepG2細胞形態(tài)觀察

在6 孔板中培養(yǎng)HepG2 細胞。培養(yǎng)結束后，采用PBS洗滌細胞2 次，加入完全培養(yǎng)基，倒置，顯微鏡下觀察HepG2細胞形態(tài)并拍照。

1.2.3 HepG2細胞ROS測定

在6 孔板中培養(yǎng)HepG2 細胞，培養(yǎng)結束后，離心收集細胞。每孔中加入1 mL 含有10 μmol/L DCFH-DA 熒光探針的無血清培養(yǎng)基，37 °C 孵育細胞20 min。采用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞3次，流式細胞儀上檢測。

1.2.4 HepG2細胞氧化指標的測定

在T-25 瓶中培養(yǎng)HepG2 細胞。培養(yǎng)結束后，收集細胞上清，按照南京建成生物工程研究所檢測試劑盒說明書流程，測定HepG2細胞上清的LDH活性。

收集HepG2細胞沉淀，超聲破碎細胞，使用BCA法測定HepG2細胞的蛋白濃度，按照南京建成生物工程研究所檢測試劑盒說明書流程分別測定HepG2細胞的GSH-Px、GSH和GPX4的活性。

1.2.5 HepG2細胞MMP水平的測定

在6孔板中培養(yǎng)HepG2細胞。培養(yǎng)結束后，每孔加入預先配好的JC-1 染色工作液1 mL，37 °C 孵育細胞25 min。每孔加入JC-1 緩沖液1 mL，洗滌細胞2 次，再加入1 mL完全培養(yǎng)液，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），Dunnett檢驗分析對照組與氟處理組組間的差異性。結果以“平均值±標準差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 氟對HepG2細胞形態(tài)的影響（見圖1）

由圖1 可知，對照組HepG2 細胞形態(tài)大小正常較圓潤，生長良好，細胞邊緣清晰，聚集成片生長；1.88 mmol/L F-組HepG2 細胞細胞間隙增大，細胞融合率降低；2.51 mmol/L F-組HepG2 細胞數(shù)量進一步減少，部分細胞邊緣不整齊；3.76 mmol/L F-組HepG2細胞數(shù)量急劇減少，細胞無法成片生長，細胞邊緣模糊。

2.2 氟對HepG2細胞ROS水平的影響（見圖2）

由圖2 可知，與對照組相比，1.88 mmol/L F-組、2.51 mmol/L F-組和3.76 mmol/L F-組的ROS 水平分別提高了71.75%、209.80% 和411.69%；其中1.88 mmol/L F-組顯著提高（P＜0.05），2.51 mmol/L F-組和3.76 mmol/L F-組均極顯著提高（P＜0.01）。

圖2 氟對HepG2細胞ROS水平的影響Fig.2 Effect of fluoride on ROS levels in HepG2 cells

2.3 氟對HepG2細胞氧化指標的影響（見圖3）

圖3 氟對HepG2細胞氧化指標的影響Fig.3 Effect of fluoride on oxidation indexes of HepG2 cells

由圖3（a）可知，與對照組相比，1.88 mmol/L F-組、2.51 mmol/L F-組和3.76 mmol/L F-組的LDH 活性分別極顯著升高了18.38%、39.07%和54.27%（P＜0.01）。

由圖3（b）可知，與對照組相比，1.88 mmol/L F-組、2.51 mmol/L F-組和3.76 mmol/L F-組的GSH-Px活性分別極顯著降低了15.52%、27.30%和42.59%（P＜0.01）。

由圖3（c）可知，與對照組相比，1.88 mmol/L F-組、2.51 mmol/L F-組和3.76 mmol/L F-組的GSH 活性分別極顯著降低了16.73%、40.28%和52.60%（P＜0.01）。

由圖3（d）可知，與對照組相比，1.88 mmol/L F-組、2.51 mmol/L F-組和3.76 mmol/L F-組的GPX4活性分別極顯著降低了36.29%、69.42%和81.30%（P＜0.01）。

2.4 氟對HepG2細胞MMP水平的影響（見圖4）

JC-1探針聚集在正常線粒體基質中形成聚合物，顯示為紅色熒光；當細胞內(nèi)MMP 下降時，JC-1 探針只能以單體的形式存在于胞質中，顯示為綠色熒光。

由圖4 可知，與對照組相比，1.88 mmol/L F-組、2.51 mmol/L F-組和3.76 mmol/L F-組綠色熒光∶紅色熒光的值分別極顯著增加了323.72%、595.71% 和800.15%（P＜0.01），表明各試驗組MMP 水平均極顯著低于對照組（P＜0.01）。

圖4 氟對HepG2細胞MMP水平的影響Fig.4 Effect of fluoride on MMP levels in HepG2 cells

3 討論

氟在機體內(nèi)能夠與鈣、鎂等多種離子結合，參與機體的生化反應，維持動物機體正常運轉[13]；同時氟還具有破壞原生質的作用，是一種原生質毒物[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，氟作用下HepG2細胞的密度降低，數(shù)目減少，邊緣模糊。

細胞內(nèi)產(chǎn)生大量的信號分子ROS，低水平的ROS主要負責細胞存活的信號調節(jié)。癌細胞增殖需要一定水平的ROS，但過量的ROS可導致癌細胞的細胞毒性[15]。GSH具有清除氧自由基的功能；GSH-Px通過催化GSH還原細胞氧化產(chǎn)生的脂質過氧化物，減輕細胞的脂質過氧化程度。GPX4 是谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)的核心調控酶，具有清除細胞內(nèi)脂質過氧化物的毒性，維持膜脂質的穩(wěn)態(tài)的作用[16]。由于GPX4使用GSH作為催化底物，故GSH含量降低將直接影響GPX4的催化作用[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)，氟降低了HepG2 細胞內(nèi)GSH-Px 活性，GSH和GPX4含量也有所降低，提示氟能夠干擾HepG2細胞氧代謝過程，刺激細胞產(chǎn)生過量的氧自由基ROS，細胞內(nèi)的過氧化損傷超過了細胞的抗氧化能力；氟能夠抑制HepG2細胞抗氧化酶的活性，導致細胞的氧化損傷。

線粒體作為ROS 產(chǎn)生的主要細胞器，也是ROS 攻擊的主要靶點之一，ROS引起的脂質過氧化會導致膜性成分的氧化降解[18]。正常的MMP 是ATP 生成的條件，本試驗發(fā)現(xiàn)，當細胞的MMP 較低時，其生成ATP 的能力下降，影響了線粒體對細胞的供能[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，氟作用下HepG2細胞上清液中LDH活性明顯增高，表明細胞膜的完整性被破壞[20]。本試驗中，在顯微鏡下也觀察到了氟作用下HepG2細胞邊緣模糊，提示氟造成細胞膜性結構損傷。

4 結論

氟打破了HepG2細胞抗氧化系統(tǒng)平衡，引起細胞氧化應激反應，造成細胞的氧化損傷，影響線粒體的功能，嚴重破壞HepG2細胞正常的形態(tài)結構。