長順綠殼蛋雞腸道菌群結(jié)構(gòu)及基因功能分析

木 仁，格根圖雅，張 歡，冉田田，陳 志，文 狄，馬 媛，徐文斌

（1. 黔南民族師范學(xué)院生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)院，貴州黔南 558000 ；2. 浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058）

雞腸道中存在數(shù)量龐大、種類繁多的微生物菌群。微生物菌群不僅與營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收相關(guān)，也與機體免疫密切相關(guān)。Yan 等[1]指出，飼料效率與乳桿菌屬相對豐度存在明顯的相關(guān)性，盲腸微生物群在提高飼料效率方面具有重要作用。Mahmoud等[2]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌的補充可加深商業(yè)肉雞空腸隱窩深度，提高回腸對粗蛋白的消化率。直接飼喂市售益生菌可顯著增加肉雞胸腺的呼吸頻率，極顯著提高外周血單核細(xì)胞ATP 濃度及周轉(zhuǎn)率，產(chǎn)生特異性免疫球蛋白G（IgG）的速度更快[3]。近年來，隨著高通量測序技術(shù)快速發(fā)展，針對蛋雞腸道微生物進(jìn)行了大量研究。腸道微生物組成受品種、性別、日齡和日糧等因素的綜合影響，并在不同腸段間存在一定差異[4-5]。但上述研究主要集中于商品化程度較高的蛋雞品種，針對地方雞種的研究較少。本試驗以貴州省特有品種的長順綠殼蛋雞為研究對象，利用16S rRNA高通量測序技術(shù)，對十二指腸、回腸和盲腸內(nèi)容物的菌群結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)行綜合評價，以期為長順綠殼蛋雞的飼養(yǎng)管理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

20 只健康、體重?zé)o明顯著差異的27 周齡長順綠殼蛋雞，購自貴州省長順縣某長順綠殼蛋雞養(yǎng)殖場。

參照《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 33—2004）配制日糧，基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Tab.1 Composition and nutrient levels of basal diet (air-dry basis)

1.2 飼養(yǎng)管理

每只雞單獨飼養(yǎng)于籠內(nèi)（籠寬36 cm×長48 cm×高38 cm），自由飲食，雞舍溫度（22±2）℃，每日保持連續(xù)光照16 h，按照日常管理程序進(jìn)行清掃消毒。試驗期35 d。

1.3 試驗方法

1.3.1 各腸段內(nèi)容物的收集

試驗最后1 d，所有雞禁食12 h，選擇4 只雞頸靜脈放血處死。打開腹腔，十二指腸和回腸兩端及盲腸的近端結(jié)扎剪下，快速轉(zhuǎn)移至超凈工作臺。無菌剪刀剪開各腸段腸壁，無菌藥匙取出內(nèi)容物，放入無菌離心管，-80 ℃保存。

1.3.2 DNA提取及高通量測序

采用HiPure Stool DNA Kit 提取樣品微生物總DNA，Qubit? dsDNA HS Assay Kit檢測濃度。

16S rRNA V3 和V4 區(qū)擴(kuò)增引物為：F 5'-CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT-3'和R 5'-GGACTACNVGGGTWTCTAATCC-3'。

擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性5 s，57 ℃退火90 s，72 ℃延伸10 s，24個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

PCR 擴(kuò)增結(jié)果鑒定（1.5% 瓊脂糖凝膠電泳）后，利用Infinite 200 PRO 酶標(biāo)儀（Tecan）檢測文庫濃度，通過Illumina MiSeq 平臺測序，擴(kuò)增和測序工作由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Vsearch 1.9.6 軟件[6]對有效序列進(jìn)行聚類，相似性水平為97%[7]。 將序列聚類成為操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）。基于Qiime 1.9.1 軟件將OTUs代表序列與Silva數(shù)據(jù)庫（https://www.arb-silva.de/）進(jìn)行比對，RDP classifier貝葉斯算法[8]對OTUs代表序列從門到屬進(jìn)行物種注釋，通過Qiime 1.9.1軟件計算α多樣性指數(shù)。使用PICRUSt v1.0.0軟件[9]完成宏基因組的預(yù)測，結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋，從而獲得功能豐度信息。

將α多樣性指數(shù)、菌群和富集基因相對豐度數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 25.0 軟件，采用單因素方差分析中的LSD 法分析符合正態(tài)分布及方差齊性的數(shù)據(jù)，不符合的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗中的Kruskal-Wallis 法進(jìn)行分析。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 各腸段內(nèi)容物的菌群測序結(jié)果（見表2、圖1）

由表2可知，盲腸的原始序列、有效序列及OTUs數(shù)量最多，十二指腸最少。

表2 各腸段內(nèi)容物的菌群測序結(jié)果Tab.2 Sequencing results of bacterial flora in the contents of each intestinal segment

由圖1 可知，3 組共有的OTUs 為2 個，十二指腸特有4個、回腸特有17個、盲腸特有236個。

圖1 各腸段內(nèi)容物的菌群Venn圖Fig.1 Venn diagram of microflora of content of each intestinal segment

2.2 各腸段菌群α多樣性分析結(jié)果（見表3）

由表3 可知，隨著腸道的延伸，α 多樣性指數(shù)明顯增加。其中，盲腸的Ace 指數(shù)、Chao-1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)極顯著高于十二指腸和回腸（P＜0.01）。盲腸的Simpson指數(shù)顯著高于十二指腸（P＜0.05）。回腸Ace 指數(shù)和Chao-1指數(shù)顯著高于十二指腸（P＜0.05）。

表3 各腸段菌群α多樣性分析結(jié)果Tab.3 Analysis results of α diversity of intestinal flora

2.3 各腸段腸道菌群門水平相對豐度（見表4）

由表4 可知，十二指腸和回腸共注釋到2 個相對豐度高于1%的菌門，分別為厚壁菌門和放線菌門，其中厚壁菌門為絕對優(yōu)勢菌門；而盲腸共注釋到3個相對豐度高于1%的菌門，分別為擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門，其中擬桿菌門和厚壁菌門為優(yōu)勢菌門。十二指腸和回腸的厚壁菌門相對豐度極顯著高于盲腸（P＜0.01），但擬桿菌門相對豐度極顯著低于盲腸（P＜0.01），變形菌門相對豐度顯著低于盲腸（P＜0.05）。

表4 各腸段腸道菌群門水平相對豐度Tab.4 Relative abundance of gut flora in each intestinal segment at phylum level單位：%

2.4 各腸段腸道菌群屬水平相對豐度（見表5）

由表5 可知，平均相對豐度高于1% 的共有19 個屬。其中十二指腸3個，回腸2個，盲腸17個。十二指腸和回腸的優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬，平均相對豐度分別高達(dá)94.133%和95.273%，極顯著高于盲腸（P＜0.01）。盲腸的優(yōu)勢菌屬為擬桿菌屬，平均相對豐度為40.548%，極顯著高于十二指腸和回腸（P＜0.01）。

表5 各腸段腸道菌群屬水平相對豐度Tab.5 Relative abundance of intestinal flora in each intestinal segment 單位：%

2.5 各腸段KEGG分析結(jié)果（見表6～表8）

表6 各腸段KEGG一級通路的富集基因相對豐度Tab.6 Relative abundance of enriched genes in KEGG primary pathway in each intestinal segment 單位：%

表8 各腸段新陳代謝相關(guān)KEGG三級通路富集基因相對豐度Tab.8 Relative abundance of genes enriched in KEGG tertiary pathway related to metabolism in each intestinal segment 單位：%

由表6 可知，富集基因相對豐度高于1% 的KEGG 一級通路共5個。其中新陳代謝通路中富集基因相對豐度最高（44.74%～49.34%）。回腸環(huán)境信息處理通路的富集基因相對豐度顯著高于盲腸（P＜0.05），但未分類的基因相對豐度顯著低于盲腸（P＜0.05）。

由表7 可知，富集基因相對豐度高于1% 的KEGG 二級通路共18 個，其中十二指腸16 個，回腸17 個，盲腸18 個。盲腸輔因子與維生素的代謝以及聚糖生物合成與代謝通路中，富集基因相對豐度極顯著高于十二指腸和回腸（P＜0.01）。盲腸能量代謝、轉(zhuǎn)錄以及分類與降解通路中，富集基因相對豐度顯著高于回腸（P＜0.05）。盲腸氨基酸代謝及其他次生代謝物的生物合成通路中，富集基因相對豐度顯著高于十二指腸（P＜0.05）。回腸膜運輸通路中富集基因相對豐度極顯著高于盲腸（P＜0.01）。

表7 各腸段KEGG二級通路富集基因相對豐度Tab.7 Relative abundance of genes enriched in KEGG secondary pathway in each intestinal segment 單位：%

由表8 可知，富集基因相對豐度高于1% 的KEGG 新陳代謝相關(guān)三級通路共11 個，其中十二指腸9 個，回腸8個，盲腸10個。十二指腸嘧啶代謝通路富集基因相對豐度顯著高于盲腸（P＜0.05）。盲腸甲烷代謝以及丙氨酸、天冬氨酸與谷氨酸代謝通路富集基因相對豐度極顯著高于十二指腸和回腸（P＜0.01）。

3 討論

前人基于PCR-DGGE技術(shù)分析普通商品蛋雞消化道不同部位菌群組成，發(fā)現(xiàn)盲腸內(nèi)菌群最豐富，其次為回腸，十二指腸豐富度最低[10]。本研究基于16S rRNA高通量測序技術(shù)，首次檢測長順綠殼蛋雞十二指腸、空腸和盲腸菌群結(jié)構(gòu)，并結(jié)合PICRUSt 對功能進(jìn)行了預(yù)測，發(fā)現(xiàn)隨著腸道延伸，α多樣性指數(shù)及特有OTUs個數(shù)明顯增加。

腸道主要微生物為厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門[1,11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，長順綠殼蛋雞十二指腸和回腸的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門，平均相對豐度高于96%。與京紅蛋雞空腸[12]、新楊黑羽蛋雞和海蘭褐回腸[13]厚壁菌門相對豐度高于90%的研究結(jié)果較為相近；但與矮小型褐殼蛋雞[1]、羅曼蛋雞[11]和京紅蛋雞[12]的等研究結(jié)論具有一定差異。新楊黑羽蛋雞和海蘭褐盲腸厚壁菌門相對豐度分別為54%和52%，擬桿菌門分別為27% 和33%[13]，與本研究結(jié)果具有一定差異。乳桿菌屬是蛋雞十二指腸和空腸主要的菌屬，擬桿菌屬是盲腸主要菌屬，但上述菌屬相對豐度在不同研究中差異較大[1,11-13]，此差異主要與不同日齡、不同品種、飼料營養(yǎng)成分差異及飼養(yǎng)環(huán)境等綜合因素有關(guān)。

張艷[14]基于KEGG 數(shù)據(jù)庫，對科寶500、羅斯308 和矮腳黃雞等的前腸與后腸的微生物功能基因進(jìn)行了對比分析；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前腸有關(guān)遺傳信息處理的復(fù)制與修復(fù)和翻譯通路中富集基因相對豐度較高，但遺傳信息處理的轉(zhuǎn)錄、折疊、分類與降解及環(huán)境信息處理的膜運輸通路中的基因富集情況與本研究結(jié)果相比具有一定差異，但具體原因需進(jìn)一步探索。矮小型褐殼蛋雞代謝相關(guān)的功能基因主要富集于盲腸[1]。后腸氨基酸代謝、能量代謝、輔因子與維生素代謝等通路中富集基因相對豐度較高[14]，與本研究結(jié)果類似。本研究發(fā)現(xiàn)，盲腸甲烷代謝和丙氨酸、天冬氨酸與谷氨酸代謝通路中富集基因相對豐度極顯著高于十二指腸和回腸，表明盲腸中大量微生物參與營養(yǎng)物質(zhì)的消化代謝，與該部位已知消化吸收功能相符。

4 結(jié)論

長順綠殼蛋雞不同腸段微生物多樣性由低到高的順序為十二指腸＜回腸＜盲腸。十二指腸和回腸主要菌屬為乳酸桿菌屬，盲腸主要菌屬為擬桿菌屬。各腸段微生物功能基因主要富集于KEGG的新陳代謝通路，其中盲腸氨基酸代謝、能量代謝和輔因子與維生素代謝等通路的富集基因相對豐度較高。盲腸微生物的營養(yǎng)代謝作用更活躍。