丹頂鶴的保護遺傳學與保護基因組學研究

李菲凡 胡東宇

(沈陽師范大學，遼寧古生物博物館，遼寧省東北亞生物進化與環境變遷重點實驗室，沈陽，110034)

丹頂鶴(Grusjaponensis)為鶴形目(Gruiformes)鶴科(Gruidae)大型鳥類，目前被世界自然保護聯盟(IUCN)瀕危物種紅色名錄列為易危(VU)物種，也是國家一級重點保護野生動物[1]，野外現存數量不足4 000只[2]。

作為一地區性分布物種，歷史上丹頂鶴夏季廣泛繁殖于東北亞地區的大型濕地，冬季遷徙到長江中下游地區、朝鮮半島和日本本州甚至更南部地區越冬[3-5]，目前野生丹頂鶴分為大陸和島嶼2個種群。大陸種群(約2 000只)夏季主要在俄羅斯遠東與中國東北交界地區繁殖，冬季在中國東部沿海和朝鮮半島的非軍事區越冬。黑龍江省境內的松嫩平原和三江平原濕地是國內丹頂鶴的主要繁殖地，江蘇省鹽城沿海地區和山東省境內的黃河三角洲地區是國內丹頂鶴的主要越冬地[2，4，6]。島嶼種群(約1 900只)終年生活于日本北海道東部地區，春秋僅有越冬地和繁殖地間的短距離移動，所以也被稱為日本北海道種群[2-3，6]。

由于大規模的土地開發和大量捕殺，至19世紀末，分布于日本的丹頂鶴數量急劇減少，曾一度被認為已經滅絕。目前的島嶼種群來自20世紀20年代在北海道東部的未開發濕地中僅存的30余只丹頂鶴[3]。經過保護，特別是50年代開始的冬季人工投食，島嶼種群數量逐漸得到恢復，至2020年發展到1 900只[7]。由于從小種群發展而來，一定程度上經歷了種群瓶頸效應，因此島嶼種群的遺傳多樣性一直令人擔憂[6-8]。對大陸種群實施的保護始于20世紀80年代，在我國境內越冬的丹頂鶴于20世紀末增加到接近1 200只，此后不斷減少，目前已不到500只[9]，同時棲息地也在不斷地縮小和破碎化[10-12]，大陸種群是否會重蹈島嶼種群的覆轍也令人擔憂。

遺傳多樣性是物種演化的基礎，保護遺傳學研究為瀕危物種保護提供理論依據。在過去的丹頂鶴保護過程中，雖然面臨著樣本獲取困難和測試費用昂貴等難題，但還是有一些與保護遺傳學相關的研究被開展。21世紀以來，隨著高通量測序技術，特別是二代和三代測序技術的應用，保護基因組學研究應運而生，為瀕危物種的科學保護提供了前所未有的機遇[13]。本文回顧了過去40年對丹頂鶴全面實施保護以來，在丹頂鶴保護遺傳學與保護基因組學研究上已取得的成果，探討了目前丹頂鶴大陸種群遺傳多樣性保護所面臨的挑戰，以及新的基因組學技術對今后丹頂鶴保護的潛在作用。

1 丹頂鶴的保護遺傳學研究

保護遺傳學(conservation genetics)是保護生物學和分子遺傳學相互滲透、結合而產生的一門分支學科，已成為保護生物學研究的一個核心部分[14]，主要研究內容包括：物種的分類地位、種群遺傳結構和遺傳多樣性、近親繁殖、遺傳變異、基因流、雜交、遷移、親系關系、有效種群大小、種群的亞分化和進化顯著單元等方面[14]。在過去40年里，丹頂鶴保護遺傳學研究主要集中在系統演化、種間關系和物種的遺傳多樣性等方面。

1.1 丹頂鶴在鶴類系統演化中的位置

關于丹頂鶴所在鶴科15種鶴的種間關系，前后有通過DNA-DNA雜交[15]、蛋白質電泳分析[16]、線粒體細胞色素b基因序列[17-18]、線粒體細胞色素b和NADH脫氫酶亞基6基因序列測序[19]、多基因(4個線粒體基因和3個核基因)序列測序[20-21]和線粒體全基因組序列測序[22]等進行的多項研究，這些研究得出了基本一致的結果(圖1)。系統發育分析進一步支持了鶴科的單系性，并且其內部存在著種組(species group)分化，丹頂鶴、灰鶴(G.grus)、白頭鶴(G.monacha)、美洲鶴(G.americana)、黑頸鶴(G.nigricollis)形成了一個種組，被稱為美洲鶴種組(species group Americana)[22]?；诰€粒體DNA序列，對鶴科各物種的分異時間所做的貝葉斯估計顯示，各物種的分異發生在新近紀，丹頂鶴于7.9百萬年～9.0百萬年前最早從美洲鶴種組分出(圖1)。主要用鶴屬線粒體全基因組進行的系統演化分析[23]也得出了相同的結果。

圖1 基于全線粒體DNA序列的鶴類系統樹(基于Krajewski等[22]修改)

1.2 島嶼種群與大陸種群間遺傳多樣性差異

關于丹頂鶴島嶼種群與大陸種群間的遺傳多樣性差異，目前主要通過線粒體DNA片段測序和以微衛星為主的核遺傳標記分析進行研究。各種研究共同表明，丹頂鶴島嶼種群與大陸種群(不論是野生種群，還是人工飼養種群)相比，具有較低的遺傳多樣性水平，并且在過去的近百年間一直維持著一個較低的遺傳變異水平。

1999年，日本學者Hasegawa等[8]對來自日本各動物園、水族館的丹頂鶴等鶴類的線粒體DNA控制區(D環區)全DNA序列進行了測序，比較種間和種內的序列變化，并使用其中最易變的418 bp序列評估丹頂鶴大陸與島嶼種群間的遺傳多樣性差異。研究顯示，丹頂鶴、灰鶴和白頭鶴的種內遺傳距離相似。在丹頂鶴大陸種群中發現了7個D環單倍型，而島嶼種群只有2個(Gj1、Gj2)，兩者間不存在相同的單倍型。簡約網絡(parsimony network)分析顯示，島嶼種群的單倍型并沒有形成獨立的分支，系統發育樹也顯示2組單倍型沒有按種群分成2個單系群，強烈地支持了2個種群屬于一個譜系，無顯著的遺傳結構分化。Hasegawa等[8]認為，島嶼種群的單倍型較少，可能是由該種群從少數個體恢復而來所產生的“瓶頸”效應所致。此后，一個覆蓋了島嶼種群各主要繁殖地的更大樣本的測序分析證實，島嶼種群僅有Gj1和Gj2兩個單倍型，并且以Gj2為主，Gj1單倍型在島嶼種群中的分布存在著地域局限性[24]。為了解島嶼種群遺傳結構在時間上的變化，Akiyama等[25]從日本各博物館、研究機構等獲取1878—2001年保存的填充標本的羽毛，并使用1970—2014年在島嶼種群主要繁殖地區采集的幼鳥或亞成鳥血液或組織樣本，對線粒體D環區DNA進行測序，在已知的2種單倍型以外，又發現了一種新的單倍型Gj13，來自1997年和2007年的各1份樣本。分析結果表明：近百年來，Gj1和Gj2單倍型的頻率沒有明顯變化，Gj2頻率最低時(20世紀90年代)也達到了87.5%，Gj1頻率最高時(20世紀80年代)僅11.1%，即島嶼種群一直維持著低遺傳變異水平，而極其稀少的Gj13目前是否還存在尚不清楚。這也意味著島嶼種群的遺傳多樣性幾乎不可能靠自身獨立恢復，因此建議促進大陸和島嶼種群間的遺傳交流，如人工引入大陸種群個體提高島嶼種群的遺傳多樣性水平[25]。

與使用線粒體DNA片段的分析同期，核遺傳標記也被用于丹頂鶴大陸與島嶼種群的遺傳多樣性分析(表1)。Hasegawa等[26]從來自日本各動物園、水族館飼養的大陸個體和北海道的野生幼鶴的DNA中分離出7個微衛星基因座，都表現出明顯的等位基因變異，大陸個體表現為2～10個等位基因，島嶼種群則為1～4個等位基因，顯示大陸種群存在著明顯的等位基因變異，而島嶼種群的等位基因變異幅度相當小。對我國扎龍保護區野生、散養和圈養的3個丹頂鶴小種群應用6個微衛星分子標記位點的分析表明，3個小種群均表現出較高且相近的遺傳變異水平[27]；另外，從該保護區野生或散養個體的羽毛和蛋殼中，成功分離出12個微衛星基因座，并證實包括這些基因座在內的18個微衛星標記的每個組合對種群遺傳分析都是有效的[28]。對采自我國鹽城保護區的野生越冬丹頂鶴的羽毛樣本選擇6個微衛星基因座進行基因分型，獲得了47個等位基因，所有微衛星位點均高度多態；同時，該研究對上述樣本的線粒體細胞色素b基因序列也進行了分析，檢測出12個單倍型，系統發育分析顯示樣本的同源性較低[29]?；?4個基因座，對來自成都、上海、重慶和秦嶺動物園的丹頂鶴樣本檢測，發現其基因分型在209個等位基因中表現出高度的多態性[30]。上述研究均顯示大陸種群具有高度的遺傳多樣性。

表1 不同研究分離的丹頂鶴種群微衛星基因座的變異分析

1.3 親子鑒定與家族區域地理分布

利用1995—2006年在北海道不同巢址采集的幼鶴血液樣本和12個多態性微衛星基因座，對北海道3個主要繁殖區的種群遺傳結構的研究表明，3個區域種群間的遺傳多樣性沒有顯著差異，但似乎不是隨機婚配的種群[31]。空間自相關分析(spatial autocorrelation analysis)顯示，盡管丹頂鶴有很強的飛行能力，近距離(0～15 km)樣本間有明顯的正親緣關系，而遠距離(155～205 km)樣本間則有明顯的負親緣關系，說明在近距離的空間尺度下仍存在距離隔離。在出生地的留戀(natal philopatry)影響下的擴散和繁殖地選擇可能是這種距離隔離的主要成因[31]。

2 丹頂鶴的保護基因組學研究

保護基因組學(conservation genomics)本質上是保護遺傳學理論和基因組學技術的融合。它通過高通量測序技術，尤其是二代、三代測序技術的應用，推動了保護遺傳學研究內容和手段的革新性變化[33-34]。保護基因組學除了在傳統的保護遺傳學問題上能夠提供更加精準的研究結果以外，還能對物種的演化歷史、種群的局域適應、遺傳混合、雜交、遠交衰退和基因漸滲等方面提供更加深入的研究[33-34]。

目前，有關丹頂鶴的保護基因組學研究還處于起步階段。近年有2項研究[22-23]分別測定了丹頂鶴線粒體全基因組序列，得到了基本一致的結果。測定的序列全長分別為16 715、16 727 bp，有13和14個蛋白質編碼基因、22個tRNA基因和2個rRNA基因。2020年，丹頂鶴的全基因組序列被發表，用于研究基因與鳥類長壽的關系，這項研究鑒定出了多個與丹頂鶴長壽相關的候選基因，包括在代謝和免疫途徑中被正向選擇的基因，提供了低代謝率和長壽相關的基因證據[35]。通過與其他鳥類全基因組的比較進化分析(comparative evolutionary analysis)，估測出丹頂鶴全基因組大小為1.146 Gb，鑒定出約3 600萬個單核苷酸變異(SNV)，核苷酸多樣性為每位點1.29×10-3個核苷酸取代。與無危鳥類物種的核苷酸多樣性中位數(每位點2.49×10-3個核苷酸取代)相比，丹頂鶴的核苷酸多樣性水平低，在遺傳上與瀕危物種一致。用成對順序馬爾科夫聚類(PSMC)分析方法對丹頂鶴的歷史種群數量波動進行了模擬，顯示從上新世晚期到更新世早期(約40萬年前)，丹頂鶴的有效種群數量(Ne)減少；在晚更新世的最后一個冰期末期(70萬～10萬年前)增加。Ne在大約8萬年前達到峰值，預計約7.0×104[35]。

3 結論與展望

3.1 結論

回顧40年來的丹頂鶴保護，保護遺傳學研究主要集中在物種的系統演化和遺傳多樣性，以及島嶼和大陸種群間的遺傳多樣性差異方面。在技術應用上，證實了AFLP和微衛星分子標記可用于丹頂鶴親緣關系鑒定。保護基因組學研究雖歷史較短，但已完成了線粒體全基因組和全基因組序列的測定。以上研究顯示：(1)現存15種鶴類組成了一個單系群，丹頂鶴屬于美洲鶴種組，是該種組中最早分化出來的物種。從分化時間來說，該種組稱為丹頂鶴種組應該更為恰當。(2)丹頂鶴物種的核苷酸多樣性水平較低，在遺傳上與瀕危物種一致；島嶼和大陸種群之間，雖然不存在遺傳結構上的顯著分化，但島嶼種群的遺傳多樣性明顯低于大陸野生和人工飼養種群，近百年間一直維持著較低的遺傳變異水平，表明該種群獨立恢復或提高遺傳多樣性水平的可能性很低。

雖然丹頂鶴的保護遺傳學和保護基因組學研究已經取得了一些重要的進展，但在許多方面開展的工作還很少，甚至還沒有涉及，如大陸種群內部各區域分布種群的遺傳多樣性分化和各區域種群間的基因交流等。新的基因組學技術可為上述保護遺傳學問題提供更加精準的研究結果，使之前難以開展的大規模系統性研究變成可能。為此，我們對目前迫切需要解決的丹頂鶴保護遺傳學問題和未來的保護基因組學研究作出以下探討和展望。

3.2 展望

3.2.1 關于島嶼種群的遺傳多樣性的恢復

丹頂鶴島嶼種群的遺傳多樣性很低，表明19世紀末至20世紀初，島嶼種群的極度減少導致了遺傳多樣性的嚴重喪失[26]。同樣，由瀕臨滅絕的小種群恢復而來的美洲鶴，遺傳多樣性也一直維持在一個低水平狀態[36]。在沒有顯著遺傳結構分化的前提下，促進大陸與島嶼種群間的基因自然交流，或通過大陸個體或基因的人工引入方式提高島嶼種群的遺傳多樣性水平，應該是目前可取且可行的方案，但在實施之前，有必要對丹頂鶴物種的演化歷史和大陸種群的遺傳結構與遺傳多樣性進行全面了解和把握，依此制定具有遺傳學依據的實施方案。

3.2.2 關于大陸種群內部地理性遺傳變異和遺傳多樣性差異的研究

物種的分布區(繁殖地、越冬地和遷徙路徑)是在長期演化過程中形成的，在分布區內又形成了各區域種群，這一區域性及其演化過程應在基因上有所體現[37]。對丹頂鶴島嶼種群的研究也顯示：即使在很小的分布區域內，個體的基因交流也不是隨機的，雄性個體的出生地留戀性比雌性更強，出生地留戀的棲息地選擇可能導致小尺度距離隔離[31]。與島嶼種群相比，大陸種群有廣泛的地域分布，通常依據繁殖地、遷徙路線和越冬地的明顯差異分成東、西部2個區域種群，即使在各區域種群分布區內，也存在著各繁殖地間的地理隔離。因此，大陸種群內部或許也存在著地理性遺傳變異和遺傳多樣性差異，或者某種特定的偏性擴散模式，對此尚不可知。在大陸種群，特別是我國境內繁殖越冬種群面臨縮小和消失的情況下，認識與評價各區域種群的遺傳結構特征和進化意義，了解區域種群間以及內部的基因交流方式，對深入認識和有效管理大陸種群、保護種群的進化潛力具有十分重要的意義，并且迫在眉睫[14]。

3.2.3 關于人工種群的譜系調查和遺傳管理

目前，國內動物園和鶴類保護區飼養著一個數量超出國內繁殖越冬野生種群的人工種群[38]。對于瀕危物種保護來說，人工飼養種群是一種重要的資源儲備[13]，但目前對這一人工種群的譜系和遺傳特征了解得很少，基本上不清楚[30]。作為瀕危物種保護的一個重要環節，譜系登記和基因信息庫的建設必不可少，以保證放歸自然個體的譜系和遺傳信息是清楚的，對野生種群的遺傳多樣性影響是可預判的，從而實現對種群的遺傳管理[32]?？梢栽谝延械难芯炕A上，利用AFLP和微衛星等分子標記技術建立一個統一的標記體系，用于查明各人工飼養種群的譜系，建立基因信息庫，進行統一監測和管理。

3.2.4 對保護基因組學研究的展望

目前，基因組學已從結構基因組學轉向功能基因組學的后基因組時代，高通量測序技術也日漸成熟，正在成為特定鳥類研究領域的常規工具。低成本、短時間的高通量測序技術使大規模研究成為可能，如單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)分析，相比多態性微衛星標記方法，在種群遺傳交流、親緣地理和區域適應，以及物種的演化歷史等各研究層次上均具有更高的解析力[39]，可用于丹頂鶴的相關研究。Xu等[40]用基因分型測序(genotyping-by-sequencing)方法開發了33個丹頂鶴的SNP標記，未來可將該標記體系用于基因信息庫建設、丹頂鶴的遺傳多樣性保護和管理。此外，基因組學的高通量測序技術可以比保護遺傳學方法更好地解析生物結構、功能與環境之間的協同演化關系，如能夠提取環境中全部微生物DNA的宏基因組學(metagenomics)研究[34]，未來也將成為深入研究丹頂鶴生理、行為、食性、疾病、生長發育和環境適應等課題的重要手段[35，41-42]。