浙江長興揚子鱷種群遺傳多樣性研究

方黎明 付春正 李 慧 鄒衛強 任大斌 徐菊敏 韓群花 萬秋紅 方盛國*

(1.長興尹家邊揚子鱷自然保護區，長興，313100；2.浙江大學生命科學學院，生命系統穩態與保護教育部重點實驗室(浙江大學)，國家瀕危野生動植物種質基因保護中心(浙江大學)，杭州，310058)

生物多樣性是指地球上生存的所有動物、植物、微生物和這些生物所擁有的所有遺傳物質，以及由這些生物構成的生態系統，即由遺傳多樣性、物種多樣性和生態系統多樣性三部分組成，其中遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，是自然界中物種或種群內各種不同等位基因的總和，表現為在生物體遺傳上的千差萬別[1-5]。遺傳多樣性能夠反應物種或種群的遺傳變異水平，生物的遺傳多樣性越高，其對環境的適應能力就越強，生存能力也就越強，因此遺傳多樣性是衡量物種或種群生存、進化和環境條件適應的關鍵指標[6-7]。此外，遺傳多樣性也是保護生物學研究的重要內容之一，它可以在一定范圍內決定物種的數量及分布范圍，如果缺乏對生物的遺傳多樣性研究，就無法準確地認識物種種群的地理分布格局、進化歷史、適應機理、物種數量增長和滅絕等問題[8-9]。

微衛星標記因多態性豐富、共顯性遺傳、易于檢測且有效性高和重復性好等特點，在分析物種或種群的遺傳多樣性及系統進化關系中表現出巨大的優勢，被認為是研究物種或種群遺傳變異的最優分子標記，廣泛應用于羊、馬、牛、豬和雞等家畜、家禽的遺傳多樣性研究[10-18]。此外，微衛星標記檢測因對模板DNA要求低，且操作過程簡捷、高效和自動化，在對瀕危野生動物如揚子鱷(Alligatorsinensis)、東北馬鹿(Cervuscanadensis)、朱鹮(Nipponianippon)、大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)、虎(Pantheratigris)、豹貓(Prionailurusbengalensis)、丹頂鶴(Grusjaponensis)、東北梅花鹿(Cervusnipponhortulorum)和西伯利亞狍(Capreoluspygargus)[19-27]等的保護遺傳學研究中，該檢測技術的應用越來越廣泛。

揚子鱷是中國特有的珍稀瀕危物種，屬爬行綱(Reptilia)，鱷形目(Crocodylia)，鼉科(Alligatoridae)，短吻鱷屬(Alligator)[28-29]。該物種曾廣泛分布于我國大部分區域，南起海南儋州，北到新疆呼圖壁；西起新疆呼圖壁，東至浙江余姚，均有揚子鱷分布[30]。但隨著氣候變遷、人類對揚子鱷的過度捕殺及人類對揚子鱷棲息環境的破壞，導致揚子鱷分布范圍大幅縮小，現今揚子鱷主要分布于浙江長興和安徽宣城[30-31]。浙江長興尹家邊揚子鱷保護區始建于1979年，最初的種群由11條奠基揚子鱷個體組成，截至2019年9月，該保護區揚子鱷數量已達6 691條[32-33]。浙江長興尹家邊揚子鱷保護區由核心區和野放區兩部分組成，核心區為揚子鱷研究繁育中心，即最初建設的揚子鱷保護區所在區域；野放區在“國家Ⅱ期工程”——浙江省揚子鱷放歸自然建設項目的資助下于2009年開始建設，2011年完成[32，34]。2012年4月15日，保護區首次從核心區甄選120條揚子鱷放歸至野放區，作為野放區的奠基種群[34-35]。自此，保護區每年都從核心區內挑選一定數量的7～8齡的揚子鱷放歸至野放區，截至2019年7月，已有960條揚子鱷被放歸至野放區[34，36-37]。隨著野放區揚子鱷的繁殖，野放區揚子鱷已經繁衍發育成一個數量較大的種群。

已有研究[32，38-40]大多利用微衛星標記對浙江長興尹家邊揚子鱷保護區揚子鱷種群個體進行親子鑒定，或對保護區揚子鱷種群遺傳多樣性進行整體性分析，并未對核心區和野放區揚子鱷種群遺傳多樣性進行單獨分析和比較，導致保護區核心區和野放區揚子鱷種群遺傳多樣性差異研究尚有不足。因此，本研究通過隨機采集浙江長興尹家邊揚子鱷保護區核心區和野放區的成年揚子鱷血液樣本，利用微衛星標記技術，對核心區和野放區種群進行遺傳多樣性分析，從而了解核心區和野放區種群的遺傳多樣性及種群遺傳分化情況，為核心區揚子鱷放歸至野放區提供分子水平上的理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與DNA提取

1.2 微衛星標記及引物信息

13個多態性較高的微衛星標記信息見表1[38-39，43]。引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，上游引物的5′端進行熒光修飾(FAM、HEX或TAMRA)。

表1 微衛星標記信息

續表1

1.3 PCR擴增及STR擴增產物掃描分析

使用20.0 μL PCR擴增反應體系，包括2×TaqMaster Mix(上海捷瑞生物工程有限公司)10.0 μL，ddH2O 8.0 μL，模板DNA 1.0 μL，上、下游引物各0.5 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，在各引物對應的退火溫度下退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴增34個循環；72 ℃終延伸5 min，4 ℃保存。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳(120 V，30 min)檢測，將擴增成功的PCR產物送至Invitrogen(上海英俊)生物技術有限公司進行STR擴增產物掃描分析，確定擴增產物片段大小。

1.4 數據統計分析

使用GeneMarker v1.5讀取STR擴增產物掃描分析結果，確定微衛星標記片段大小；使用Excel Microsatellite Toolkit version 3.1計算等位基因頻率、等位基因大小范圍、多態信息含量和數據格式轉化；等位基因數量、有效等位基因數量、觀測雜合度、期望雜合度、香農信息指數和F-統計值用POPGENE 1.32計算；分子方差分析(AMOVA)、FST矩陣計算和基因流計算由Arlequin 3.5.2.2完成。

2 結果與分析

2.1 等位基因分布及頻率

核心區和野放區130條揚子鱷在13個微衛星標記中共檢測到31個等位基因，其中含有2個稀有等位基因(基因頻率<5.00%[44])。13個微衛星標記在核心區和野放區揚子鱷種群中均表現出多態性，微衛星標記CXA-9、CXA-34、CXA-35、CXA-43和CXA-136均具有3個等位基因，其余8個微衛星標記均具有2個等位基因。核心區和野放區揚子鱷種群在13個微衛星標記上均具有相同的31個等位基因，平均等位基因數量均為2.38個。

13個微衛星標記的等位基因頻率在保護區核心區和野放區揚子鱷種群間存在差異。CXA-4微衛星標記的等位基因共有2個，大小分別為123、128 bp，核心區揚子鱷種群基因頻率較高的等位基因是128 bp(64.62%)，而野放區為123 bp(52.31%)；CXA-41微衛星標記的等位基因共有2個，大小分別為156、160 bp，核心區揚子鱷種群基因頻率較高的等位基因是160 bp(57.69%)，而野放區為156 bp(53.08%)；CXA-43微衛星標記的等位基因共有3個，大小分別為113、117、129 bp，核心區揚子鱷種群基因頻率較高的等位基因是為113 bp(56.92%)，而野放區為117 bp(49.23%)。其余10個微衛星標記CXA-6、CXA-9、CXA-34、CXA-35、CXA-37、CXA-39、CXA-135、CXA-136、CXA-138和CXA-142，雖然每個微衛星標記的等位基因在核心區和野放區揚子鱷種群間的基因頻率存在差異，但每個微衛星標記的較高基因頻率的等位基因是一致的，如CXA-35微衛星標記的等位基因共有3個，大小分別為110、114、118 bp，核心區和野放區揚子鱷種群基因頻率較高的等位基因均為114 bp，頻率分別為87.69%和90.00%。此外，基因頻率<5.00%的等位基因包括微衛星標記CXA-9的117 bp，核心區和野放區揚子鱷種群中該基因的頻率分別為3.08%和0.77%；微衛星標記CXA-35的118 bp，核心區和野放區揚子鱷種群該基因的頻率分別為3.08%和4.62%(表2)。

表2 核心區和野放區揚子鱷種群13個微衛星標記的等位基因長度和頻率

2.2 微衛星標記的遺傳多樣性

保護區揚子鱷種群中的各遺傳多樣性參數詳見表3。13個微衛星標記的等位基因數量為2或3個，平均等位基因數量為2.38個；有效等位基因數量為1.26～2.59個，平均有效等位基因數量為1.88個，平均等位基因數量與平均有效等位基因數量存在差異。有效等位基因數量最高的微衛星標記是CXA-34，為2.59個；有效等位基因數量最低的微衛星標記是CXA-35，為1.26個。

表3 保護區揚子鱷種群13個微衛星標記的遺傳多樣性參數

13個微衛星標記的觀測雜合度為0.21～0.75，平均觀測雜合度為0.50，觀測雜合度最高的微衛星標記為CXA-34；觀測雜合度最低的微衛星標記為CXA-9和CXA-35。13個微衛星標記的期望雜合度為0.20～0.62，平均期望雜合度為0.45，期望雜合度最高的微衛星標記為CXA-34；期望雜合度最低的微衛星標記為CXA-35。微衛星標記CXA-9和CXA-43的觀測雜合度低于其期望雜合度。

13個微衛星標記的多態信息含量為0.19～0.54，平均多態信息含量為0.36，多態信息含量最高的微衛星標記為CXA-34；多態信息含量最低的微衛星標記為CXA-35。微衛星標記CXA-34和CXA-43為高度多態標記(多態信息含量>0.50[16])；微衛星標記CXA-4、CXA-6、CXA-9、CXA-37、CXA-39、CXA-41、CXA-136、CXA-138和CXA-142為中度多態標記(0.25<多態信息含量<0.50[16])；微衛星標記CXA-35和CXA-135為低度多態標記(多態信息含量<0.25[16])。13個微衛星標記的香農信息指數為0.42～1.01，平均香農信息指數為0.68，香農信息指數最高的微衛星標記為CXA-34，最低的為CXA-35。

微衛星標記CXA-34的各遺傳多樣性參數，包括有效等位基因數量、觀測雜合度、期望雜合度、多態信息含量和香農信息指數的數值在13個微衛星標記中均最高，表明該微衛星標記的遺傳變異最大，遺傳多樣性最豐富；相反，微衛星標記CXA-35的各遺傳多樣性參數在13個微衛星標記中均最低，表明該微衛星標記的遺傳變異最小，遺傳多樣性最匱乏。

2.3 核心區和野放區揚子鱷種群遺傳多樣性

核心區和野放區揚子鱷種群具有相同的平均等位基因數量，但核心區揚子鱷種群的平均有效等位基因數量高于野放區；核心區揚子鱷種群的平均觀測雜合度、平均期望雜合度、平均多態信息含量和平均香農信息指數均高于野放區，表明野放區揚子鱷種群相較于核心區揚子鱷種群的遺傳變異少，遺傳多樣性相對缺乏(表4)。

表4 核心區和野放區揚子鱷種群的遺傳多樣性參數

2.4 保護區揚子鱷種群的遺傳變異與分化

在保護區揚子鱷種群具有的總遺傳變異中，有96.83%的遺傳變異來源于各種群內個體間的遺傳變異，僅有3.17%的遺傳變異來源于核心區和野放區種群間的遺傳變異，表明保護區種群內的遺傳變異主要來源于個體之間的遺傳變異，核心區和野放區揚子鱷種群間的遺傳變異較少，遺傳分化程度較低(表5)。

表5 保護區揚子鱷種群遺傳變異的分子方差分析結果

13個微衛星標記在浙江長興尹家邊揚子鱷保護區揚子鱷種群中的FIS值為-0.409 5(CXA-142)～0.289 9(CXA-9)，平均值為-0.153 1，其中只有微衛星標記CXA-9的FIS值為正值，其余12個微衛星標記的FIS值均為負值；13個微衛星標記在保護區揚子鱷種群中的FIT值為-0.387 6(CXA-41)～0.301 4(CXA-9)，平均值為-0.130 0，其中微衛星標記CXA-9和CXA-43的FIT值為正值，其余11個微衛星標記的FIT值均為負值，且13個微衛星標記的FIS值均小于FIT值；13個微衛星標記在保護區揚子鱷種群中的FST值為0.000 2(CXA-37、CXA-39和CXA-136)～0.056 7(CXA-135)，平均值為0.020 0(表6)。

13個微衛星標記在保護區核心區和野放區揚子鱷種群中的FIS值分別為-0.607 3(CXA-142)～0.413 7(CXA-9)和-0.588 4(CXA-34)～0.0851(CXA-35)；13個微衛星標記在保護區核心區和野放區揚子鱷種群中的FIT值與其自身的FIS值相同，且13個微衛星標記在保護區核心區和野放區揚子鱷種群中的FST值均為0(表6)。此外，保護區核心區與野放區的FST值為0.031 7，基因流為7.631 5(表7)，表明保護區核心區和野放區揚子鱷種群的遺傳分化程度較低。

表6 13個微衛星標記的F-統計值

表7 核心區和野放區揚子鱷種群間的FST值和基因流

3 討論

在微衛星標記的等位基因中，若某一等位基因的頻率很高，那么該等位基因則很容易遺傳給子代；而若某一等位基因的頻率<5.00%，則稱為稀有等位基因，其在生物種群繁衍過程中，遺傳給子代的概率很小，很容易在種群繁衍過程中消失[26，44]。因此，在保護瀕危動物種群繁衍過程中所發現的稀有等位基因，也是瀕危動物遺傳多樣性研究的重要內容[26]。本研究中的13個微衛星標記在浙江長興尹家邊揚子鱷保護區揚子鱷種群中共檢測到稀有等位基因2個，占所有等位基因的6.45%，分別為微衛星標記CXA-9，長度為117 bp，該基因在核心區和野放區種群中的頻率分別為3.08%和0.77%；微衛星標記CXA-35，長度為118 bp，該基因在核心區和野放區種群中的頻率分別為3.08%和4.62%。稀有等位基因是生物進化的重要成果，同樣也是遺傳多樣性保護的重要內容，特別是對于像浙江長興尹家邊揚子鱷保護區中人工繁殖的瀕危小種群，檢測到的2個稀有等位基因很可能是最初揚子鱷種群中相對普遍存在的等位基因，但由于20世紀60年代的氣候變遷，人類對揚子鱷的過度捕殺和人類對揚子鱷棲息環境的破壞，造成了揚子鱷種群的遺傳瓶頸以及在保護過程中人工選擇造成的基因頻率下降。因此，為了保護浙江長興尹家邊揚子鱷保護區揚子鱷種群的遺傳多樣性，這些稀有等位基因更應該得到重視[24，26，45]。在將來的揚子鱷繁育保護過程中，研究人員應該重點關注具有稀有等位基因的揚子鱷個體，如有必要，可對其進行集中飼養繁育，防止稀有等位基因在揚子鱷隨機交配繁衍過程中丟失，造成保護區揚子鱷種群遺傳多樣性的進一步下降。此外，需對保護區揚子鱷種群的遺傳多樣性進行定時檢測，監測核心區和野放區揚子鱷種群內稀有等位基因動態變化情況，如發現其中一個區域的揚子鱷種群稀有等位基因頻率快速下降且呈消失趨勢，應及時在另一種群內選取合適揚子鱷個體補充至稀有等位基因即將消失的種群內。

衡量微衛星標記多態性的一個重要指標是多態信息含量，當一個標記的多態信息含量>0.50時為高度多態標記；0.25<多態信息含量<0.50時為中度多態標記；多態信息含量<0.25時為低度多態標記[6，46]。此外，微衛星標記的多態信息含量還與該標記的可用性和使用效率相關，微衛星標記的多態信息含量越大，在一個生物種群中該標記的雜合子比例就越大，提供的遺傳信息就越多[46]。本研究使用的13個微衛星標記的多態信息含量為0.19～0.54，平均多態信息含量為0.36，其中2個微衛星標記為高度多態標記，9個微衛星標記為中度多態標記，2個微衛星標記為低度多態標記，因此本研究使用的13個微衛星標記可作為研究浙江長興尹家邊揚子鱷保護區揚子鱷種群遺傳多樣性的有效遺傳標記[47]。浙江長興尹家邊揚子鱷保護區野放區揚子鱷種群的平均有效等位基因數量、平均觀測雜合度、平均期望雜合度、平均多態信息含量和平均香農信息指數均低于保護區核心區揚子鱷種群，表明保護區野放區揚子鱷種群的遺傳多樣性相對缺乏。這一結果可能與在野放過程中未對核心區揚子鱷種群、野放區揚子鱷種群以及挑選的野放個體的遺傳多樣性進行系統性分析有關。

本研究利用13個微衛星標記對浙江長興尹家邊揚子鱷保護區揚子鱷種群進行遺傳多樣性分析，并比較保護區核心區和野放區揚子鱷種群的遺傳多樣性差異，了解了浙江長興尹家邊揚子鱷保護區揚子鱷種群在生存和繁衍過程中可能存在低頻等位基因丟失的情況。本研究僅檢測到2個稀有等位基因，因此在后續的揚子鱷種群保護繁殖過程中，保護區應注重對低頻等位基因及稀有等位基因的監測和保護。此外，本研究還發現，雖然2012—2019年保護區核心區揚子鱷種群中已有960條揚子鱷被放歸至野放區，但保護區野放區揚子鱷種群的遺傳多樣性與核心區揚子鱷種群仍存在一定差異[36-37]，野放區揚子鱷種群的平均有效等位基因數量、平均觀測雜合度、平均期望雜合度、平均多態信息含量和平均香農信息指數均低于核心區揚子鱷種群，因此在后續的揚子鱷野外放歸過程中，保護區應注重分析核心區和野放區揚子鱷種群的遺傳多樣性，保證保護區揚子鱷種群的遺傳多樣性不會在野放過程中降低，從核心區揚子鱷種群中挑選出合適的野放個體進行野外放歸，從而豐富野放區揚子鱷種群的遺傳多樣性。