基于形態學及分子生物學鑒定廣西昭覺林蛙的分布

張廷瑞 白林壯 黃亮亮 蔣正杰 岑財貴 郜二虎 貝永建

(1.桂林理工大學環境科學與工程學院，桂林，541000；2.玉林師范學院生物與制藥學院，玉林，537000；3.廣西金鐘山黑頸長尾雉國家級自然保護區管理中心，隆林，533400；4.國家林業和草原局調查規劃設計院，北京，100714)

蛙科(Ranidae)林蛙屬(Rana)物種主要分布于歐亞大陸和美洲大陸，中國目前記錄分布有27種，其中廣西有4種，即徂徠林蛙(Ranaculaiensis)、寒露林蛙(R.hanluica)、越南趾溝蛙(R.johnsi)和貓兒山林蛙(R.maoershanensis)[1]。昭覺林蛙(R.chaochiaoensis)隸屬于蛙科林蛙屬，主要分布于四川、云南和貴州[1-2]，關于昭覺林蛙在廣西是否有分布曾經存在爭議。2006年，陸宇燕等[3]在廣西貓兒山采集到1種林蛙，經形態鑒定為昭覺林蛙，并以《廣西兩棲動物一新紀錄——昭覺林蛙》發表在《四川動物》上。但在2007年，Lu等[4]因在貓兒山采集到的昭覺林蛙標本形態特征不同于其他林蛙屬物種，又重新將其確定為新種——貓兒山林蛙，并于2010年通過16S rRNA構建系統發育樹，分子生物學證據顯示，確定Yang等在廣西貓兒山采集到林蛙屬標本為貓兒山林蛙，而不是昭覺林蛙[5]。費梁等[2]和莫運明等[6]認為目前已有的資料和證據不足以說明廣西分布有昭覺林蛙。因此，對于昭覺林蛙在廣西是否有分布還缺乏有力的證據。

2021年7月，調查人員在廣西金鐘山黑頸長尾雉國家級自然保護區(24°34′5.06″ N，104°54′18.15″ E；海拔1 359 m)進行全國第二次陸生野生動物資源調查時采集到林蛙屬標本1號(發現時，該標本剛被車輛碾壓致死)，編號Ylussy0040，經形態學鑒定比較，與昭覺林蛙相似；經分子生物學分析，確定該標本為昭覺林蛙，為昭覺林蛙在廣西的分布提供了形態學及分子生物學證據。

1 材料與方法

1.1 材料

取標本的肝臟組織保存于95%乙醇溶液中，用于提取總DNA。Ylussy0040標本浸泡在10%的福爾馬林溶液中，保存于玉林師范學院。

1.2 形態鑒定

參照《中國兩棲動物及其分布彩色圖鑒》[2]對標本進行形態鑒定。

1.3 分子鑒定

利用天根血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(DP304)提取總DNA。利用常規PCR擴增12S rRNA(引物H56/L13和H1478/L1091)和16S rRNA(引物H10/L2A和H4551/L3975)部分基因片段，引物序列見表1，PCR擴增條件和步驟參照Lyu等[7]的研究。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將片段大小符合要求的產物交廣州艾基生物技術有限公司雙向測序，測序引物為PCR擴增產物。

表1 引物序列信息

從GenBank下載包含12S rRNA和16S rRNA的21個林蛙屬和蛙科部分相近物種的基因序列(表2)，結合本次調查中的標本序列，進行分子系統發育分析，以無指盤臭蛙(Odorranagrahami)和黑斑側褶蛙(Pelophylaxnigromaculatus)為外群。在MEGA 7[8]中利用Align by Clustl W對所下載序列比對，人工校對比對后的序列，結果基于Kimura雙參數模型計算物種間的遺傳距離。使用貝葉斯法(Bayesian inference of phylogeny，BI)和最大似然法(maximum likelihood method，ML)構建系統發育樹。用PhyloSuit v1.2.2軟件選擇最適模型[9]，構建BI系統發育樹和ML系統發育樹(ML系統發育樹進行5 000次Bootstrap重抽樣分析)。

表2 構建林蛙屬系統發育樹的相關序列

2 結果與分析

2.1 形態描述

Ylussy0040標本吻端鈍尖、突出于下唇，吻棱明顯，頰部稍向外傾斜有一淺凹陷，瞳孔呈橢圓形，背側褶較寬厚而平直，在顳部上方不彎曲，從眼后直達胯部；體側棕紅色，散布不規則的小黑點，四肢背面有粗細不一的黑色橫紋；背側褶色淺，其上的橘紅色小點明顯，背側褶間有隱約可見的不規則斑紋(圖1A)；皮膚較平滑，有分散的圓疣，體背為紅棕色，并散有橘紅色小點(圖1B)；手、趾指細長，上、下唇緣有灰黑色斑點，腹面光滑，呈乳黃色或乳白色，近胯部及股腹面為橘紅色(圖1C)。經形態學比較，采集于廣西隆林的林蛙標本Ylussy0040與昭覺林蛙在形態特征上相符合。

圖1 標本Ylussy0040的形態特征

2.2 系統發育分析

標本Ylussy0040的12S rRNA和16S rRNA基因片段經過比對拼接后，得到的有效序列長度為1 761 bp(12S rRNA長度為731 bp，16S rRNA為1 030 bp)，基因序列上傳到GenBank，登錄號為OL583993(12S rRNA)和OL444874(16S rRNA)。

基于BI和ML構建的系統發育樹顯示出相似的拓撲結構。BI發育樹顯示，采自隆林的林蛙標本Ylussy0040與昭覺林蛙模式標本(四川昭覺)聚為一支，且具有較高的支持率(100.0%)(圖2)；ML發育樹顯示，采自隆林的林蛙標本Ylussy0040與昭覺林蛙模式標本相聚后構成單系，且具有較高的支持率(99.0%)(圖3)。基于Kimura雙參數模型估算的遺傳距離表明，標本Ylussy0040與昭覺林蛙模式標本之間的遺傳距離為0.4%，除標本Ylussy0040外，其他物種之間的遺傳距離為1.0%～21.8%，Ylussy0040與昭覺林蛙模式標本的遺傳距離遠小于林蛙屬其他物種(表3)。

圖2 基于12S rRNA和16S rRNA基因序列構建的林蛙屬部分物種貝葉斯系統發育樹

圖3 基于12S rRNA和16S rRNA基因序列構建的林蛙屬部分物種最大似然系統發育樹

表3 基于12S rRNA基因和16S rRNA基因計算林蛙屬部分物種的遺傳距離

經形態學和分子生物學系統發育分析，結合BI發育樹、ML發育樹和遺傳距離結果，確定采集于廣西金鐘山黑頸長尾雉國家級自然保護區的標本Ylussy0040為昭覺林蛙，明確了昭覺林蛙在廣西的分布。

2.3 生境描述

廣西金鐘山黑頸長尾雉國家級自然保護區位于廣西壯族自治區西部，云貴高原邊緣，在氣候帶上處于南亞熱帶。標本Ylussy0040采集于海拔1 359 m的郁閉度較高的山地常綠闊葉林林緣(圖4)，位于保護區的核心區，周圍植被茂盛，多為常綠闊葉林，采集點附近分布的兩棲類動物有飾紋姬蛙(Microhylafissipes)、澤陸蛙(Fejervaryamultistriata)和鋸腿原指樹蛙(Kurixalusodontotarsus)等。

圖4 廣西昭覺林蛙的發現地

3 討論

廣西地處云貴高原的東南邊緣，跨中亞熱帶、南亞熱帶和北亞熱帶3個氣候區，氣候溫暖濕潤，降雨量豐沛，地形地貌復雜，植被種類多樣，孕育了豐富多樣的兩棲動物，其中林蛙屬物種分布廣泛，由于大多數物種形態較為相似，導致在野外很難鑒定[2]。近年來，隨著分子生物學的發展，形態比較結合分子系統學分析方法對物種進行鑒定已被廣泛應用[10-15]。

昭覺林蛙的體色隨生境不同而改變，生活于林地的體色呈深棕色或棕黑色，生活于水邊的體色為淺棕色，生活于深草中的為黑褐色[16]。標本Ylussy0040與昭覺林蛙模式標本相比，在形態上一致，與廣西的4種林蛙屬物種(徂徠林蛙、寒露林蛙、越南趾溝蛙和貓兒山林蛙)相比，標本Ylussy0040體背為紅棕色，并散有橘紅色小點，區別于徂徠林蛙(體背多為紅褐色或棕灰色而無深色斑)和貓兒山林蛙(體背面多為紅褐色或褐色，具有黑褐色條形斑或點狀斑)，標本Ylussy0040左右跟部重疊較多，區別于徂徠林蛙(左右跟部重疊)、寒露林蛙(左右跟部明顯重疊)和貓兒山林蛙(左右跟部僅相遇)，標本Ylussy0040頰部有一淺凹陷，區別于越南趾溝蛙頰部凹陷。

昭覺林蛙主要分布于四川西南部、云南和貴州西部[2]，標本Ylussy0040的采集地在廣西百色市隆林縣的廣西金鐘山黑頸長尾雉國家級自然保護區內。隆林縣位于云貴高原的邊緣，與云南和貴州的昭覺林蛙分布點很近，從地理位置上看，昭覺林蛙在隆林縣分布具有很大的可能性。另外，該標本的采集地為海拔1 359 m的郁閉度較高的山地常綠闊葉林林緣，周圍植被茂盛，環境潮濕，與昭覺林蛙模式標本的生境非常相似。

不同地理分區的同一物種會產生一定的遺傳分化，物種間遺傳距離越小，親緣關系就越近。本研究從GenBank下載包含12S rRNA和16S rRNA的林蛙屬和蛙科部分相近物種的基因序列構建系統發育樹，計算遺傳距離，發現Ylussy0040與鎮海林蛙(Ranazhenhaiensis)、大別山林蛙(R.dabieshanensis)、峨眉林蛙(R.omeimontis)、長肢林蛙(R.longicrus)、寒露林蛙和越南趾溝蛙的遺傳距離分別為3.8%、3.8%、3.9%、4.4%、4.7%和7.4%，和昭覺林蛙模式標本的遺傳距離僅為0.4%，遠小于其他林蛙屬物種的遺傳距離，且在系統發育樹上與昭覺林蛙形成單系。因此，結合分子生物學分析和形態學比較，鑒定標本Ylussy0040為昭覺林蛙，為昭覺林蛙在廣西分布提供了新證據，也豐富了昭覺林蛙的分布信息。