基于COⅠ和16S rRNA基因的涉案鳥類殘體鑒定

劉大偉 應耿迪 周用武 費宜玲 吳文達 謝春平 侯森林*

(1.南京森林警察學院野生動植物物證技術國家林業和草原局重點實驗室，南京，210023；2.南京農業大學，南京，210095；3.廣東海洋大學，湛江，524088)

野生動物是人類生存和發展的重要資源，同時是生物多樣性的重要組成部分，在維護生態系統安全穩定以及生態服務中起重要作用[1-2]。近年來隨著我國經濟的快速發展，巨大的市場需求驅使非法野生動物交易頻發，這不僅破壞生物多樣性，同時以食用野生動物為目的的動物交易也對公共衛生安全構成了嚴重威脅[3-4]。為了打擊該類犯罪行為，更好地保護珍貴的野生動物資源，對涉案的野生動物及其制品進行科學、準確的物種鑒定至關重要，其結論能夠為司法機關辦理此類案件提供有力支撐。

傳統的野生動物物種鑒定主要基于形態學和解剖學特征，同時十分依賴與模式標本的比對，專業性要求極強。然而，在打擊野生動物犯罪的工作中，查獲的往往是動物的殘骸、卵、幼體或加工后的制品，這些物品的形態特征較為模糊甚至缺失，無法通過外觀形態進行物種鑒定。DNA條形碼技術的出現解決了上述難題，這項技術是利用足夠變異、容易擴增且相對較短的DNA片段完成對物種的識別鑒定[5]，該片段的具體特征主要表現為物種內特異性、物種間多樣性[6]。與傳統形態學鑒定相比，條形碼技術不受物種發育階段、性別以及完整性的影響。在具體的操作方面，該技術簡單、便捷，易于標準化，具有通用性強和準確性高等優點，可一次性對多個樣本進行鑒定[7]。目前，該技術已廣泛應用于動物鑒定領域。Bhattachan等[8]基于線粒體細胞色素c氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)序列對來自中國東北的3種海鞘綱(Ascidiacea)動物進行物種鑒定；馮慧等[9]通過COⅠ和細胞色素b(Cytb)對飛機撞擊后的鳥類殘體進行鑒定，確定其為家燕(Hirundorustica)；Moura等[10]基于16S rRNA亞基區分差異較小的水螅蟲綱(Hydrozoa)的動物。當前，最理想的情況是能夠找到一條DNA序列來鑒別所有物種，但是由于核基因和細胞器基因不同區域的進化速率不同，加之不同物種的相同區域的進化速率也具有一定的差異，就目前的研究結果，這種情況難以實現[11]。因此，不同動物類群的最適條形碼不同，研究者可根據其研究對象的遺傳特征和自身的研究目的建立符合需求的條形碼。

對于DNA條形碼的篩選需要滿足2個方面的要求：一是該基因能夠穩定、大量擴增，需要足夠保守；同時，對不同物種的DNA序列能夠進行區分，滿足鑒定的需要，也要有一定的變異[12]。因此，選擇合適的基因是DNA條形碼技術能夠成功應用的關鍵[13]。目前，線粒體DNA的COⅠ和16S rRNA是物種鑒定中常選用的目的基因，其中，COⅠ是最早提出和使用最廣泛的條形碼[14]。然而有學者指出，雖然COⅠ基因進化速度緩慢，突變速率較低，但在某些低等生物和鳥類的鑒定中不如其他基因穩定，針對這些類群動物的DNA條形碼篩選應謹慎選擇該基因片段[15-17]。相較于COⅠ，16S rRNA序列較容易擴增，尤其是在一些水螅蟲綱中較為明顯[10]，也可作為一種有效的條形碼序列，用以區分形態差異小以及尚未描述的物種[18-19]。作為COⅠ的補充，也應將16S rRNA作為動物鑒定的標準條形碼[20]。

2021年1月，浙江省湖州市某公安機關在一起非法狩獵案中，從犯罪嫌疑人處扣押了1件鳥類殘體。根據外觀推測，該鳥類殘體可能屬于鶴形目(Gruiformes)或鸛形目(Ciconiiformes)物種。本研究擴增了該鳥類殘體的COⅠ和16S rRNA序列，通過從GenBank數據庫中搜索同源序列進行近緣物種的親緣關系分析，結合系統發育樹，對鳥類殘體所屬物種進行鑒定，為有效打擊野生動物資源犯罪、為司法機關定罪量刑提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

樣本是從浙江省湖州市某公安機關辦理的一起當地非法狩獵案中查獲的1件鳥類殘體(圖1)。

圖1 鳥類殘體

1.2 DNA提取及PCR擴增

使用眼科剪剪取約25 mg樣本，置于1.5 mL EP管中。采用DNA提取試劑盒(TaKaRa公司)提取樣品基因組DNA，具體方法參考試劑盒說明書。提取的DNA置于TE緩沖液中，-20 ℃保存。

根據鶴形目和鸛形目動物線粒體DNA的COⅠ和16S rRNA基因特征，選取保守區域序列，使用Primer Premier 5.0軟件設計引物(表1)。

表1 引物序列

使用Veriti 9902 PCR儀(美國AB公司)進行PCR擴增，所有PCR反應體系均為25 μL。

COⅠ和16S rRNA的反應程序均為95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃終延伸10 min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶清晰的產物采用Sanger法雙向測序。

1.3 序列比對與分析

利用Chromas軟件檢查所獲原始數據，確認序列質量，同時，為了避免核基因中假線粒體基因可能存在的干擾，進行序列的開放閱讀框架確認，保證其能夠進行氨基酸的翻譯。將確認質量后的序列提交至GenBank在線數據庫(https：//blast.ncbi.nlm. nih.gov)比對分析，并下載相似度高的同源序列。用ClustalX軟件多重比對，再用MEGA 7.0軟件Kimura 2-parameter(K2P)模型中的Transition substitution(Ts)替換類型分別分析COⅠ和16S rRNA片段的序列差異[21]，計算K2P遺傳距離[22]。

基于BIC標準(Bayesian information criterion)，使用ModelFinder軟件，檢驗最大似然法(maximum likelihood，ML)的最適模型[23-24]。使用IQ-TREE v.1.6.8進行最大似然樹的構建[25]，1 000次自舉法(bootstrap)多次檢查樹分支的支持率。在Figtree 1.4.0中查看和編輯系統發育樹。利用PopART v1.7軟件構建單倍型網絡圖。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果

鳥類殘體樣本COⅠ和16S rRNA引物均獲得約1 000 bp的特異性條帶(圖2)。

圖2 鳥類殘體樣本的COⅠ和16S rRNA PCR產物

2.2 序列分析

COⅠ基因片段的有效序列長度為885 bp，堿基組成：A占26.21%，G占30.40%，T占28.14%，C占15.25%。比對結果表明，該樣本與登錄號為FJ769846和MH041490的白鶴(Leucogeranusleucogeranus)序列相似度分別為95.93%和100.00%，與登錄號為LC541482和FJ769852的白枕鶴(Antigonevipio)序列相似度分別為98.98%和99.89%，與其他鶴科(Gruidae)動物的相似度均低于97.00%(表2)。

16S rRNA基因片段的有效序列長度為801 bp，堿基組成：A占20.38%，G占27.12%，T占34.75%，C占17.75%。比對結果表明，該樣本與登錄號為DQ485850、FJ769852和LC541482的白枕鶴序列相似度均為99.88%，與其他鶴科動物的相似度均較低(表2)。

表2 鳥類殘體樣本的BLAST比對結果和遺傳距離

續表2

2.3 遺傳距離和系統發育分析

基于COⅠ片段，鳥類殘體樣本與白鶴FJ769846、MH041490序列的遺傳距離分別為0.041和0，與白枕鶴LC541482、FJ769852序列的遺傳距離分別為0.007和0.001，與其他鶴科動物的遺傳距離均較大，高于種間變異水平(表2)。基于16S rRNA片段，鳥類殘體樣本與白枕鶴DQ485850、FJ769852和LC541482序列的遺傳距離均為0，與其他鶴科動物的遺傳距離均較大。

針對COⅠ、16S rRNA序列，ML的最適模型分別為HKY+F+I+G4和TN+F+R2。

基于COⅠ基因序列構建發育樹，發現鳥類殘體樣本與白鶴和白枕鶴屬同一分支，沒有構成單系(圖3)。基于16S rRNA基因序列構建發育樹，鳥類殘體樣本與白枕鶴的序列以較高的支持率構成單系(圖4)。

圖3 基于COⅠ基因序列的系統發育樹

圖4 基于16S rRNA基因序列的系統發育樹

根據16S rRNA基因序列的近緣物種序列比對結果、遺傳距離和系統發育樹結果，鳥類殘體所屬物種初步鑒定為白枕鶴。從COⅠ基因的相關結果可以看出，鳥類殘體樣本不能與白鶴(MH041490)和白枕鶴(LC541482、FJ769852)序列相區分，而與另外一條白鶴序列(FJ769846)無論從遺傳距離還是系統發育樹均能區分。對MH041490序列進一步分析表明，其與2條白枕鶴序列(LC541482、FJ769852)的遺傳距離分別為0.001和0.007，與其同源序列的遺傳距離卻高達0.041，且在系統發育樹中，該序列與白枕鶴序列聚為同一支，而與其同源序列(FJ769846)距離較遠，因此為保證結果的可靠性，MH041490序列不適合作為本次鑒定的參考序列。從單倍型網絡圖可以看出，樣本與Antigone物種，尤其與白枕鶴距離較近，而與白鶴的距離較遠(圖5)。綜合以上分析，送檢鳥類殘體樣本最終被鑒定屬于白枕鶴。

圖5 基于COⅠ基因序列(A)和16S rRNA基因序列(B)的單倍型網絡結構

3 討論

獵捕和非法貿易是野生動物面臨的主要威脅，是其種群數量下降的主要原因之一[26]，常見的獵捕和非法貿易的野生動物主要為雁鴨類、鳩鴿類和小型雀形目(Passeriformes)鳥類[27]。本研究中發現的白枕鶴也作為不法分子的獵捕目標，在以往的案件中較為罕見。全球野生白枕鶴種群數量為6 250～6 750只[28]，2021年頒布的《國家重點保護野生動物名錄》將該物種由二級提升至一級，足見其瀕危程度。白枕鶴為遷徙性鳥類，在我國主要繁殖于東北、內蒙古等地區，冬季遷徙到長江中下游的濕地越冬[29]，在湖州發現該物種分布應屬首次。因此，野生動物主管部門應開展相關監測，進一步做好該物種的保護工作。

在物種鑒定中，DNA條形碼是較常用的工具[5]，Cytb、COⅠ和16S rRNA基因片段被認為是較為有效的分子標記[30-32]。在預試驗中，由于Cytb片段不能很好地區分鳥類殘體樣本與其他幾種鶴科鳥類，沒有做進一步分析。本研究選擇了COⅠ、16S rRNA基因片段作為條形碼，有效性受到種內和種間遺傳距離的影響。如果鳥類殘體樣本與目標物種的每一個參考序列的遺傳距離均小于樣本與其他物種的遺傳距離，則可初步確定該樣本的物種來源；反之，則不能確定[22，33]。本研究中，樣本與其他鶴類的遺傳距離大于與白枕鶴的遺傳距離，存在明顯的條形碼間隔，因此，COⅠ片段和16S rRNA片段均能對鳥類殘體樣本進行有效的物種鑒定。

通常情況下，一條變異水平適宜的DNA條形碼序列即可達到物種鑒定的目的，很多研究都采用了這種方法對物種鑒定[34-35]。本研究選取了2個線粒體基因片段進行物種鑒定，采取這種策略的優勢主要體現為：首先，保證一次鑒定的成功率，某些情況下，只有1個基因片段不能夠提供物種水平的鑒定[36]；其次，核基因中存在線粒體假基因，在PCR擴增過程中存在將其擴增出來的可能，使用2個基因片段同時擴增可以相互印證，排除核基因的干擾[37]，還能提高鑒定的準確率[38]。

在DNA條形碼開發過程中，目的片段的長度一般不超過700 bp[39]。更有學者在保證序列變異水平適宜的前提下，針對DNA易發生降解的檢材，如埋藏于地下的動物化石等，開發了長度約150 bp的微條形碼，這種短序列片段大大提高PCR成功率，同時有利于后續系統發育分析[40]。本研究選取了線粒體COⅠ和16S rRNA基因片段進行引物設計，片段長度大于700 bp。在引物設計時，發現部分鶴科動物的這2個基因片段相似度較高，小于700 bp的片段不能保證條形碼的區分度，因此通過增加目的片段長度的方法來提高區分度。

GenBank數據庫包含了地球上大量生物的遺傳學信息，為全世界科研工作者提供了有力的數據支撐。在物種鑒定時僅利用該數據庫將測序完畢的DNA條形碼序列進行BLAST同源搜索即可完成相關鑒定工作[41-42]。然而本研究發現，針對COⅠ基因片段，使用該方法進行物種鑒定時不能很好地區分白鶴和白枕鶴，需要結合遺傳距離法和構建系統發育樹方法對相關序列進行更深入地分析。在案件涉及物種鑒定，尤其是對近緣物種鑒定時，BLAST比對結果僅可作為參考，需結合遺傳距離和系統發育樹綜合分析后再做出鑒定結論[43-44]。為了保證鑒定結果的可靠性和準確性，同時方便一線鑒定工作的開展，提出了可以推廣到其他野生動物物種鑒定的操作流程(圖6)。

圖6 物種鑒定的工作流程

DNA條形碼技術能夠準確獲得物種的遺傳信息，在對缺乏完整形態信息的動物制品鑒定時優點尤為突出，具有其他技術無法取代的地位。然而，GenBank數據庫中的錯誤序列并不罕見[45]，如果使用這些序列進行數據分析可能會影響鑒定結論的準確性。因此，在使用該數據庫進行物種鑒定時，如發現有異常序列，需要查找源頭，同時使用遺傳距離、系統進化等方法綜合分析，以排除錯誤序列對鑒定結論的干擾[46]。