小熊貓犬瘟熱病毒分離鑒定及其H基因序列分析

陳詩涵 黃紫貝 管飄萍 郭 鑫 王海燕 金文杰 劉文博，4*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院傳染病學(xué)教研室，揚(yáng)州，225009；2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州，225009；3.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，泰州，225300；4.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物疾病檢測(cè)與技術(shù)服務(wù)中心，揚(yáng)州，225009)

犬瘟熱病毒(Canine distemper virus，CDV)是一種高度傳染性病毒，可在家養(yǎng)和野生犬科(Canidae)、熊科(Ursidae)及非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物等多種動(dòng)物中引起多系統(tǒng)、亞臨床甚至致命的疾病[1-4]。近年來，由于野生動(dòng)物園的快速發(fā)展，犬瘟熱病毒的自然宿主暴露和接觸頻率有所提高，對(duì)野生動(dòng)物的健康造成了巨大的威脅。犬瘟熱病無季節(jié)性，不同年齡和性別均可感染發(fā)病，幼齡動(dòng)物死亡率高達(dá)80%以上，危害嚴(yán)重[5-8]。據(jù)研究，CDV編碼的H蛋白的糖基化與其對(duì)宿主的致病性有關(guān)[9]，且H蛋白較易發(fā)生變異，因此常以血凝素H基因的變化來評(píng)估CDV毒株間的遺傳變異[10]。目前根據(jù)H基因編碼的氨基酸序列，CDV毒株已分為18個(gè)主要遺傳譜系，主要包括America Ⅰ、America Ⅱ、Asia-1、Asia-2、Asia-3、Europe、European wildlife、Arctic、South America和Southern Africa等，之后又增加了Asia-4型[11]。本研究對(duì)江蘇某動(dòng)物園小熊貓(Ailurusfulgens)犬瘟熱病診斷和病原學(xué)研究，通過對(duì)H基因測(cè)序，并對(duì)其序列進(jìn)行同源性比較和遺傳發(fā)生分析，鑒定2株CDV病毒分別為Africa毒株和European wildlife毒株，以期為野生動(dòng)物犬瘟熱病的防控提供參考。

1 基本情況

2019年10月21日，江蘇某動(dòng)物園1只小熊貓突然死亡，由于事發(fā)突然，未檢測(cè)。10月31日，又有2只小熊貓發(fā)病，用犬瘟熱膠體金試紙條檢測(cè)，結(jié)果為弱陽性，對(duì)2只小熊貓進(jìn)行血常規(guī)檢查，其中一只小熊貓紅細(xì)胞略升高，其他無異常，另一只小熊貓嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞顯著升高。

11月19日起，對(duì)患病小熊貓皮下注射頭孢拉定。11月31日起，對(duì)全體小熊貓進(jìn)行干擾素和犬瘟熱單抗治療，連續(xù)4 d，并繼續(xù)注射頭孢類藥物，但呼吸道癥狀未見明顯改善。改用康衛(wèi)寧給藥，2～3 d后未見效果，加用阿奇霉素1 d，恩諾沙星3～4 d，仍未見效果，改用美羅培南持續(xù)給藥。12月10日起，用抗CDV高免血清治療，連續(xù)4 d，期間小熊貓進(jìn)食少時(shí)，給與葡萄糖氯化鈉注射液補(bǔ)液治療，隨后病情得到控制。

2 疾病診斷方法

2.1 病理剖檢及采血

對(duì)病死小熊貓剖檢。無菌采集2管小熊貓的尾靜脈血，用PBS以1∶3倍稀釋，5 000 r/min離心5 min，取上清，用0.22 μm的濾器過濾，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 PCR檢測(cè)

取稀釋后的樣品100 μL，根據(jù)RNA simple提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)說明書提取RNA。根據(jù)TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0試劑盒(寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司)說明書，用提取的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。RT-PCR反應(yīng)體系為：MgCl22.00 μL，10×RT Buffer 1.00 μL，RNase Free dH2O 3.75 μL，RNase Inhibitor 0.25 μL，AMV Reverse Transcriptase XL 0.50 μL，Random 9 mers 0.50 μL，Sample 1.00 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：30 ℃保溫10 min，使Random 9 mers延伸達(dá)到足夠長(zhǎng)度，50 ℃退火，與模板RNA充分結(jié)合30 min，95 ℃加熱5 min，使AMV RTase失活，5 ℃冷卻5 min。參考相關(guān)文獻(xiàn)[12-13]，合成鑒定犬瘟熱病毒的引物CDV-F和CDV-R(表1)，預(yù)期擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度為455 bp。

表1 CDV鑒定及H基因擴(kuò)增的引物

PCR反應(yīng)體系：cDNA 10.00 μL，5×PCR Buffer 10.00 μL，TaKaRa E×TaqHS 0.25 μL，CDV-F 0.50 μL，CDV-R 0.50 μL，ddH2O 28.75 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳得到符合要求的PCR產(chǎn)物送往南京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

2.3 病毒分離培養(yǎng)

取出Vero-CD150細(xì)胞(此前在本實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存)復(fù)蘇，待培養(yǎng)長(zhǎng)至80%后棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗1或2次。取過濾除菌的小熊貓CDV陽性血清樣本100 μL，按1∶10的比例加入無血清DMEM(Gibco公司)，混勻后接種單層Vero細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃、5%CO2吸附2 h，棄去培養(yǎng)基，補(bǔ)加含1%G418(賽默飛世爾科技公司)的抗生素和2%胎牛血清(FBS)細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibco公司)，同時(shí)將未接毒的正常Vero-CD150細(xì)胞作為陰性對(duì)照，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞病變情況。當(dāng)Vero-CD150細(xì)胞有80%及以上出現(xiàn)細(xì)胞病變時(shí)進(jìn)行收毒，反復(fù)凍融3次，傳至第3代。所有細(xì)胞培養(yǎng)物置于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 H基因擴(kuò)增

合成3對(duì)針對(duì)犬瘟熱病毒H基因的特異性引物：CDV4F/CDV4R、CDV5F/CDV5R和CDV6F/CDV6R(表1)，預(yù)期擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度分別為471、571、1 014 bp。以上引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。擴(kuò)增細(xì)胞培養(yǎng)物H基因，PCR反應(yīng)條件參考2.2。

2.5 同源性和遺傳進(jìn)化分析

在GenBank中下載不同基因型(Asia-1、Asia-2、America-1、America-2、Africa、Arctic like、Europe和European wildlife)的CDV參考毒株(35株)，應(yīng)用DNASTAR軟件中的MegAlign分析核苷酸序列，并比對(duì)這35株參考毒株和2株分離株的基因序列。使用BioEdit進(jìn)行Clustal同源性比較，并用MEGA-X軟件的Neighbor-joining(鄰位相連法)繪制遺傳進(jìn)化樹，Bootstrap設(shè)為1 000。

3 結(jié)果與分析

3.1 病理剖檢

剖檢發(fā)現(xiàn)，病死小熊貓胸腔內(nèi)肺部充血并伴有斑塊狀出血(圖1A)，肝臟腫大，心內(nèi)膜出血(圖1B)，胃腸黏膜腫脹、出血(圖1C)。

圖1 病死小熊貓出血病變

3.2 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增后得到長(zhǎng)度約455 bp的目的條帶(圖2)。PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST分析，2份血樣均為CDV陽性，測(cè)序確定為CDV基因片段。

圖2 小熊貓血樣PCR擴(kuò)增結(jié)果

3.3 CDV分離培養(yǎng)

接種病毒的Vero-CD150細(xì)胞，24 h后均出現(xiàn)圓縮、細(xì)胞顆粒增多、融合和聚集成多核巨細(xì)胞等細(xì)胞病變效應(yīng)(圖3A)，且部分細(xì)胞脫落、壞死。連續(xù)傳代后細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)穩(wěn)定產(chǎn)生，2個(gè)毒株分別命名為SZ2019CDV1H和SZ2019CDV2H。而未接種病毒的Vero-CD150細(xì)胞則無變化(圖3B)。

圖3 分離株的犬瘟熱病變(100×)

3.4 H基因的擴(kuò)增

用犬瘟熱病毒H基因的特異性引物對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行H基因擴(kuò)增，擴(kuò)增出H基因的3段序列，電泳得到預(yù)期長(zhǎng)度的目的條帶(圖4)，測(cè)序后拼接得到完整的H基因序列，總長(zhǎng)度為1 824 bp。

圖4 細(xì)胞培養(yǎng)物中H基因3個(gè)片段的PCR產(chǎn)物

3.5 同源性分析

利用MegAlign軟件對(duì)已發(fā)表在NCBI上的其他35株CDV的H基因序列與本試驗(yàn)測(cè)得的2株CDV基因序列進(jìn)行比對(duì)。SZ2019CDV1H株與SZ2019CDV2H株的基因同源性為97.2%，兩毒株與標(biāo)準(zhǔn)European wildlife毒株Rockborn-Candur (GU266280.1)和Rockborn (GU810819.1)的同源性較高，全基因同源性達(dá)96.7%，但與America毒株同源性相對(duì)較低，特別是America-1疫苗株Snyder Hill (AF259552.1)，同源性分別僅為91.3%和91.0%(圖5)。

圖5 不同CDV毒株基因同源性

3.6 遺傳進(jìn)化樹分析

由圖6可以看出，小熊貓?jiān)碨Z2019CDV1H、SZ2019CDV2H株與其他35株代表毒株可分為8個(gè)遺傳系。從遺傳進(jìn)化樹分析，SZ2019CDV1H株與Africa毒株親緣關(guān)系較近，SZ2019CDV2H株與European wildlife毒株親緣關(guān)系較近，兩毒株均不與Convac、Vacc-Q和Vaccine等America-1疫苗毒株在同1個(gè)分支上，遺傳進(jìn)化距離相距甚遠(yuǎn)。

圖6 不同CDV毒株H基因核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

4 討論

根據(jù)小熊貓的臨床發(fā)病情況首先懷疑為犬瘟熱病毒感染，將臨床送檢的血樣進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)，在獲得陽性結(jié)果后分離和鑒定病毒，并對(duì)分離得到的病毒H基因擴(kuò)增和測(cè)序，以確定其遺傳譜系。近年來，國內(nèi)報(bào)道的引起犬[14-15]、東北虎(Pantheratigrisaltaica)[16]、水貂[17]和小熊貓[18-19]等野生動(dòng)物高病死率的主要流行犬瘟熱遺傳系為Asia-1。經(jīng)同源性分析，本研究獲得的CDV分離株與Europe毒株同源性較高；但在遺傳進(jìn)化分析上，SZ2019CDV1H株與Africa毒株同處1個(gè)分支，SZ2019CDV2H株與European wildlife毒株同處1個(gè)分支，與常見Asia-1差距較大，與America-1疫苗株遺傳進(jìn)化距離最遠(yuǎn)。這說明CDV的遺傳演變存在不同的方向性，這對(duì)基因分型和演化關(guān)系分析可能會(huì)存在一定的干擾。

因目前還沒有小熊貓?jiān)葱缘娜翢嵋呙纾覈A(yù)防此病多用犬用弱毒苗，該苗對(duì)野生動(dòng)物并不一定適用。在高強(qiáng)度的疫苗免疫壓力下，流行毒株發(fā)生變異，從而造成了市面上商品化的犬瘟熱弱毒疫苗對(duì)犬以外的物種免疫效果不佳[18]。

基因分型往往基于病毒所分離的地域[19]，而遺傳關(guān)系代表了毒株本身的變異程度。本研究在一次疫病暴發(fā)事件中分離得到了2種不同的基因型病毒，可以推斷病毒來源相對(duì)比較復(fù)雜，可能與動(dòng)物的來源及病原體在動(dòng)物園內(nèi)的散播有一定的聯(lián)系。由于數(shù)據(jù)和信息的缺乏，還不能確定此次疫病暴發(fā)的原因，但是這些復(fù)雜的病原學(xué)特征為臨床發(fā)病后的治療造成很大的困難。本研究中的數(shù)據(jù)和信息將為犬瘟熱病毒地方性流行毒株的分子流行病學(xué)調(diào)查提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，流行毒株遺傳系分析結(jié)果可為臨床篩選疫苗和治療提供一定參考。