大熊貓糞便中mtDNA拷貝數與月齡的關系

任曉彤 周永恒 李天峰 李仁貴 馬 躍，4 李德生 黃 炎 徐艷春，4，5*

(1.東北林業大學野生動物與自然保護地學院，哈爾濱，150040；2.中國大熊貓保護研究中心，都江堰，611830；3.大熊貓國家公園珍稀動物保護生物學國家林業和草原局重點實驗室，都江堰，611830；4.國家林業和草原局野生動植物檢測中心，哈爾濱，150040；5.國家林業和草原局野生動物保護與利用工程技術研究中心，哈爾濱，150040)

線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)拷貝數在其細胞能量代謝以及其他一系列細胞活動如鈣信號、鐵穩態、激素合成和細胞程序性死亡[1-3]中起著核心作用，單個哺乳動物細胞擁有成百上千個mtDNA拷貝，這種遠高于核DNA(nuclear DNA，nuDNA)的拷貝數在哺乳動物基因組復雜的進化中發揮了關鍵作用，平均每個細胞內mtDNA拷貝數(Nmpc)反映著線粒體耗竭、能量儲備和氧化應激等情況，也在一定程度上反映了機體當下的代謝狀態[4]。據此推測，機體在生長發育和衰老的過程中可能伴隨著一定規律的mtDNA拷貝數的變化。

糞便是動物的遺留物，也是動物研究中常用的非損傷性材料，無論是對野外還是飼養種群的采集都比較方便。糞便中包含的宿主DNA主要來自腸上皮細胞[5-6]，機體的生長發育和衰老伴隨著腸道功能的發育和衰退，影響腸道的生理狀態和代謝能力[7]，在這個過程中，作為能量供應中樞的線粒體中DNA拷貝數可能也會發生變動[8]，但是，變動的方式尚不了解。

大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)是世界矚目的珍稀物種[9-10]，主要以竹子為食。竹纖維經過簡單咀嚼后直接進入胃腸道，絕大多數的竹纖維都無法被消化分解[11]，經過腸道時，會黏附大量的腸道上皮細胞，并帶入糞便中，為相關研究提供足夠多、質量足夠好的DNA。人工飼養種群具有準確的出生記錄和詳細的系譜信息，本研究選用出生月份記錄清晰的圈養大熊貓的糞便為材料，研究腸道上皮細胞中mtDNA拷貝數與月齡的關系，以期揭示大熊貓不同生長發育和衰老階段腸道代謝功能的變動規律，為飼養種群和野外種群的管理提供新的視角。

1 材料與方法

1.1 樣本收集與糞便DNA提取

2021年6—7月從中國大熊貓保護研究中心的都江堰、核桃坪和耿達3個基地共采集64只11～357月齡的大熊貓的新鮮糞便(圖1)。采集時用無菌手術刀和剪刀對每個糞便樣本的頂部、尾部和中間3個部位切取表面的竹纖維，得到200～300 g的樣品，立即置于冰箱中-20 ℃暫存，在干冰中運到實驗室備用。使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit(Qiagen，德國)，按照說明書的流程提取糞便總DNA。

圖1 本研究采用的64只大熊貓的月齡分布

1.2 引物設計及有效性驗證

通過實時定量PCR方法測定nuDNA和mtDNA的拷貝數。分別以大熊貓nuDNA(NCBI參考序列號：NC048220.1)上β-actin基因和mtDNA(NCBI參考序列號：NC009492.1)上Cytb基因為目的基因設計引物對，同時以大熊貓基因組為比對數據庫通過NCBI-BLAST排除核內mtDNA片段(Numts)的干擾[12]，最終選擇nuDNA的PCR引物對為Nβ(NβF：5′-GGGGATGGCGTTACTCATACT-3′；NβR：5′-ACATCACGAACAATCTCCCG-3′)，mtDNA的PCR引物對為MC(MCF：5′-AAGTGCCCCGCCACATATTT-3′；MCR：5′-GGTCGGAATATCATGCTTCGTTG-3′)。2對引物的熔解溫度(melting temperature，Tm)均為60 ℃，片段長度分別為170、171 bp，引物由庫美生物科技有限公司合成。

2個DNA片段采用相同擴增體系和擴增程序。擴增反應在10.0 μL體系中進行，包括2 ×RapidTaqMaster Mix(南京維諾贊生物科技有限公司)5.0 μL，10 μmol/L上下游引物各0.3 μL，DNA模板2.0 μL(～40 ng總DNA)，ddH2O 2.4 μL。混勻后瞬時離心，用9700型PCR擴增儀(GeneAmp，USA) 擴增。擴增程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性20 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，30個循環；循環結束后72 ℃延伸 5 min。從2個擴增反應中分別取4 μL的擴增產物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳緩沖液為1×TAE，95 V下電泳25 min。

1.3 qRT-PCR熒光定量標準品制備

1.3.1 nuDNA和mtDNA目的基因片段處理

Nβ、MC2對引物的擴增體系等比放大至40 μL，將PCR產物在2%的瓊脂糖凝膠中，按照相同的條件電泳分離。紫外燈下切取2條目的條帶，用DNA純化回收試劑盒(Axygen，美國)分別進行回收，按照說明書操作。

純化回收的DNA經超微量分光光度計(Implen，德國)檢測濃度后，與pMD18-T載體(TaKaRa，日本)連接，將質粒轉化至EscherichiacoliDH5α感受態細胞(TaKaRa，日本)中，通過藍白斑篩選隨機挑取10個白色菌落，轉移至LB液體培養基中37 ℃下搖動培養16 h。吸取菌液1 μL，用1.2中的10 μL體系進行PCR擴增以及電泳檢測。確定陽性后，用EasyPure?Plasmid MiniPrep Kit(Trans，北京)提取質粒，操作流程按照說明書進行。提取到的2種質粒用Sange法對插入片段測序，將測序結果在NCBI上比對，確認得到目的片段。

1.3.2 建立標準品濃度梯度

用所得的陽性質粒制備標準品。用微量分光光度計測定其濃度，按照公式計算質粒拷貝數(C)：

C=n×60.2×1014×(1/660N)。

式中：n為質粒濃度；N為插入片段的長度。

用滅菌的ddH2O按照10×等比例梯度稀釋質粒，以稀釋10-7～10-2的質粒為模板，進行熒光定量PCR擴增以建立標準曲線，每個濃度做3個重復。熒光定量PCR反應在10.0 μL體系中進行，包括1.0 μL質粒溶液、5.0 μL TB Green Premix ExTaqⅡ(TaKaRa，日本)、10 μmol/L上下游引物各0.4 μL和3.2 μL ddH2O。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，72 ℃延伸30 s，40個循環；熔解段95 ℃處理15 s，60 ℃處理1 min，95 ℃處理15 s。反應用BTK-96實時熒光定量PCR分析儀(無錫百泰克生物技術有限公司)完成，繪制標準曲線。最終得到濃度為102～107拷貝/μL的標準品(Ct值10～30)。

1.4 糞便DNA中mtDNA拷貝數估算

將來自每個糞便樣品不同部位的3份DNA稀釋成近似濃度并等量混合，以此作為該個體的DNA樣品。按照1.3.2中反應體系和程序，用Nβ和MC2對引物進行擴增，檢測Ct值，并按照1.3.2中得到的標準曲線估算nuDNA和mtDNA的拷貝數。再根據公式計算平均每個腸上皮細胞中mtDNA的拷貝數(Nmpc)：Nmpc=2Nmt/Nnu，式中Nmt為樣品中總mtDNA拷貝數；Nnu為樣品中總nuDNA拷貝數。每個樣品重復3次，取均值作為最終數據。

1.5 數據分析

根據3σ原則，把測得的Nmt、Nnu和Nmpc取值超出(μ-3σ，μ+3σ)區間的認定為異常值(μ為均值，σ為標準差)。檢測到的異常值在后續分析中被剔除。對整理后的數據進行統計計算，得到Nmpc的平均值(mean)、標準差(SD)和變異系數(CV)；對所有個體的Nmt、Nnu和Nmpc取自然對數并做頻率分布直方圖；將個體月齡與Nmpc及ln(Nmpc)做線性回歸分析，得到兩者之間的關系；計算每個單獨數據減去群體均值之后的絕對值作為變異度，與群體月齡做線性回歸曲線。

考慮到性別對糞便DNA拷貝數的潛在影響，把Nmpc按照性別分組，分別計算雌、雄2組的平均值、標準差和變異系數；分別對雌、雄2組所有個體的Nmt、Nnu和Nmpc取自然對數并做頻率分布直方圖；由于樣品中雌性和雄性月齡分布略有差異，按照性別及月齡層次分布進行分層隨機抽樣，減小月齡分布偏好度的影響，抽樣比例設置為60%，對抽樣數據取對數處理后進行秩和檢驗；分別將雌、雄2組的月齡與Nmpc做線性回歸曲線；計算雌、雄2組的變異度，分別與群體月齡做線性回歸曲線。以上分析均采用SPSS 24.0(IBM Corp.USA)完成。

2 結果與分析

2.1 引物對Nβ和MC的有效性

以3只大熊貓糞便總DNA為模板，引物對Nβ和MC均擴增了目的片段(圖2)，表明這2對引物對nuDNA和mtDNA的擴增均是有效的。用大熊貓糞便DNA進行Nβ和MC引物的熒光定量PCR檢驗，引物Nβ和MC的熔解曲線如圖3所示，熔點峰值分別為85.1、80.0 ℃，熔解曲線峰值點僅有1個且高度重合，說明引物無非特異性擴增以及二聚體，可用于樣品拷貝數的分析。

圖2 3只大熊貓Nβ和MC引物擴增產物的電泳結果

圖3 引物Nβ(左)和引物MC(右)的qRT-PCR熔解曲線

2.2 qRT-PCR標準曲線

以菌液為模板，通過引物對Nβ和MC進行PCR擴增，在瓊脂糖凝膠上檢測到在170 bp左右的條帶；測得序列與NCBI上大熊貓的參考序列NC048220.1和NC009492.1的同源性均為100%，證明插入質粒的片段是目的片段。

經微量分光光度計測定，nuDNA質粒的初始濃度為129.00 ng/μL，mtDNA質粒標準品的初始濃度為119.95 ng/μL。通過計算得到的nuDNA和mtDNA拷貝數分別為6.92×1010、6.40×1010拷貝/μL。經過10×梯度稀釋后，分別用引物對Nβ和MC的熒光定量PCR檢測Ct值，并與實際拷貝數進行回歸，繪制mtDNA和nuDNA 2種標準品的標準曲線，其中nuDNA的R2值為0.990，擴增效率(E)為97.95%，曲線方程Y=-3.811X+35.264；mtDNA的R2值為0.992，擴增效率為99.52%，曲線方程Y=-4.077X+39.063(圖4)。最終得到的拷貝數檢測下限為102。

圖4 nuDNA(左)和mtDNA(右)標準品的qRT-PCR標準曲線

2.3 平均每個細胞mtDNA的拷貝數

將月齡和對應的Nmpc數據按照性別劃分，雌性和雄性月齡分別為11～357、13～336月齡，平均值分別為172、123月齡；對應的Nmpc分別為24.00～7 803.00和46.00～8 467.00，平均值分別為1 177.00和1 990.00，標準差分別為1 840.34和2 449.51，變異系數分別為56.32%和123.08%；最終雌性和雄性的變異系數/平均月齡值分別為0.9%和1.0%。分別對雌、雄2組Nmt、Nnu和Nmpc進行自然對數轉換后，其頻率分布如圖5(D-F為雌性，G-I為雄性)，對于雌性個體，Nmt跨度最大，Nmpc頻率分布最集中且跨度最小，Nnu頻率分布最分散；對于雄性個體，Nmt頻率分布最集中且跨度最大，Nmpc跨度最小，Nnu頻率分布最分散。對抽樣數據進行性別和Nmpc的秩和檢驗，顯著性為0.002。將每個性別的Nmpc進行自然對數轉換后與月齡進行線性回歸分析，結果顯示2個性別中Nmpc都隨著月齡的增加呈下降趨勢，但趨勢未達到顯著水平(圖7，雌性R2=0.060，P=0.176；雄性R2=0.110，P=0.074)。

圖5 大熊貓糞便總DNA中Nmt、Nnu和Nmpc的頻率分布

圖6 大熊貓糞便總DNA中Nmpc及其變異度與月齡的相關性

圖7 不同性別大熊貓糞便總DNA中Nmpc及其變異度與月齡的相關性

3 討論與展望

生物體內線粒體功能的發揮隨著個體生長發育而改變，長期以來，與衰老相關的線粒體功能下降一直被認為是多種生物學變化的基礎，線粒體功能改變的機制涵蓋多個領域，包括能量(ATP)產生和能量儲備的下降[13-14]，自由基產生的增加[15]，凋亡和有絲分裂速率的改變，以及融合、分裂的改變。這些關鍵的細胞內變化會導致細胞功能障礙、組織改變和疾病風險增加[16]。已有一些研究證明mtDNA異質性與衰老之間具有相關性[17-20]，有關每個細胞的mtDNA分子的數量，即每個細胞mtDNA的拷貝數與月齡之間相關性的研究卻很少。

機體細胞mtDNA拷貝數的普遍減少會破壞線粒體的整體效能，過度增加也會帶來疾病風險[21]，如人類的mtDNA拷貝數改變與癌癥、神經退行性疾病和糖尿病等衰老相關的疾病有關[22-23]。因此，從維持細胞和組織穩態的角度，mtDNA拷貝數應受到機體的嚴格控制。

本研究對大熊貓糞便中mtDNA拷貝數與月齡之間的相關性進行分析，發現mtDNA拷貝數隨著月齡的增加呈現總體下降的趨勢，并達到顯著水平(P=0.004，圖6A)。筆者推測這種趨勢可能源于mtDNA拷貝數是線粒體復制和細胞能量轉換的標志，當個體處于幼齡期時，基礎代謝率較高，線粒體的總體活動更為活躍，導致細胞中mtDNA拷貝數普遍較高；而老年個體基礎代謝水平降低[24]，在這一水平上維持能量轉化的穩態所需的mtDNA拷貝數相對減少。

綜上所述，本研究證明大熊貓腸道脫落上皮細胞中mtDNA拷貝數隨著月齡的增加而減少，且減少速率逐漸放緩。無論老幼，拷貝數都存在著一個基本水平，反映了組織對線粒體發揮功能存在基本要求。此外，性別對于mtDNA拷貝數具有明顯的影響，同一生長階段的雄性比雌性更高。這些發現都為進一步探究腸道上皮細胞mtDNA拷貝數與生長發育和衰老之間的關系，以及利用其作為指標來評估機體的生理狀況提供了依據。同時，本研究以糞便為材料獲取腸道上皮細胞的機能狀態信息，為進一步擴大糞便的應用范圍提供了范例。