成年雄性海南長臂猿腸道微生物群落組成的宏基因組學分析

李依蒙 畢 玉 金 崑*

(1.中國林業(yè)科學研究院森林生態(tài)環(huán)境與自然保護研究所，北京，100091；2.北京自然博物館，北京，100050；3.海南國家公園研究院，海口，570100；4.中國林業(yè)科學研究院自然保護地研究所，北京，100091；5.生物多樣性保護國家林業(yè)和草原局重點實驗室，北京，100091)

海南長臂猿(Nomascushainanus)是我國特有種，隸屬于靈長目(Primates)，長臂猿科(Hylobatidae)，冠長臂猿屬。自20世紀50年代以來，由于歷史原因，受人類活動影響，海南長臂猿棲息地大規(guī)模喪失，導致種群數(shù)量一度迅速減少，目前僅在我國海南熱帶雨林國家公園分布，數(shù)量為5個家庭群共35只，被列為我國一級重點保護野生動物，IUCN紅色名錄極度瀕危(CR)物種。自20世紀70年代以來，研究人員對海南長臂猿開展了一系列的研究工作，集中于棲息地及家域[1-2]、種群數(shù)量[3]、遺傳多樣性[4]、食性[5]和行為[6-8]等，未見有關(guān)海南長臂猿腸道微生態(tài)方面的研究。

腸道微生物是棲息于動物腸道中所有微生物的總稱，與宿主的健康和疾病密切相關(guān)。研究表明，腸道微生物在宿主體內(nèi)發(fā)揮著營養(yǎng)、代謝和免疫防御等重要功能[9-10]。同時，由于非人靈長類動物與人類的親緣關(guān)系最近，研究非人靈長類動物的腸道微生物組成對于人類腸道微生物的深入研究也有參考價值。近年來，我國已開展一些非人靈長類動物腸道菌群的研究，如獼猴(Macacamulatta)[11]、滇金絲猴(Rhinopithecusbieti)[12]和黑葉猴(Trachypithecusfrancoisi)[13]等。

動物糞便中的微生物組成能夠反映其腸道中微生物群落的整體情況[14]。對于海南長臂猿這種營樹上生活、極少下地的動物來說，糞便是可獲得的非損傷性樣本[15]。因此，本研究在旱季對海南長臂猿跟蹤并采集新鮮糞便樣本，基于宏基因組測序的方法揭示海南長臂猿腸道微生物組成及其功能，旨在揭示海南長臂猿腸道微生物與其食性之間的適應性關(guān)系，以期對海南長臂猿的保護與管理提供科學依據(jù)。

1 研究區(qū)概況

海南熱帶雨林國家公園坐落于海南島西南部山區(qū)(18°57′—19°11′ N，109°3′—109°17′ E)，海南省昌江縣和白沙縣內(nèi)，是我國生物多樣性最富集的區(qū)域之一，主要保護海南長臂猿及其棲息的熱帶雨林森林生態(tài)系統(tǒng)，總面積約為29 980 hm2，海拔590～1 560 m。該公園屬于熱帶季風氣候，干濕季特征分明，每年11月—翌年4月為旱季，5—10月為雨季，年平均降水量為1 657 mm，年平均氣溫21.3 ℃。公園內(nèi)的海南長臂猿食源植物約166種，隸屬于52科99屬，喜食植物為肉實樹(Sarcospermalaurinum)、金葉樹(Chrysophyllumlanceolatumvar.stellatocarpon)和南蛇藤(Celastrusorbiculatus)等[5]。

2 研究方法

2.1 糞便樣本采集

2021年1月中旬—2021年5月，采用非損傷采樣法，在海南長臂猿活動的區(qū)域進行糞便采集。采樣過程：(1)聘請4位經(jīng)驗豐富的霸王嶺林業(yè)局海南長臂猿監(jiān)測隊隊員協(xié)助糞便樣本的采集，在清晨海南長臂猿鳴叫之前到達監(jiān)聽點，聽到鳴叫后，根據(jù)鳴叫聲找到海南長臂猿家族群后用望遠鏡跟蹤觀察，基于個體大小、晨鳴等行為對個體進行識別，發(fā)現(xiàn)海南長臂猿排便后立即前往采集。為了確保糞便新鮮，只采集現(xiàn)場觀察到排便的個體。(2)佩戴一次性無菌手套采集糞便，用解剖刀切除沾有泥土的部分，將無污染的中心部分放入15 mL無菌離心管中密封做好標記。(3)盡快將樣品冷凍保存，由移動冰箱帶回實驗室，-80 ℃保存，用于后續(xù)試驗。最終根據(jù)采集到的樣本情況選擇4個家庭群內(nèi)的5只成年雄性海南長臂猿的糞便進行分析，糞便樣品信息見表1。

表1 海南長臂猿糞便樣品信息

2.2 宏基因組測序

海南長臂猿糞便中的DNA提取使用DNeasy PowerSoil Pro Kit(QIAGEN，Hilden，Germany)，依照說明書操作。使用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證提取基因組DNA的完整性，如果電泳條帶單一、明亮且無明顯的拖帶現(xiàn)象，說明基因組DNA完整且無降解。基因組DNA的濃度、純度使用Qubit dsDNA HS Assay Kit(Life Technologies，Carlsbad，USA)來確定。基因組文庫的構(gòu)建和上機測序交付北京百邁克生物科技有限公司完成，利用Illumina NovaSeq(Illumina Inc.，San Diego，CA，United States)測序平臺進行宏基因組測序。

2.3 生物信息學分析

使用Trimmomatic v0.36對測序后得到的原始數(shù)據(jù)質(zhì)控、過濾，得到有效數(shù)據(jù)，然后使用MEGAHIT v1.0進行宏基因組組裝，過濾短于300 bp的contig序列。采用MetaGeneMark v3.26進行基因預測，接著使用MMseqs2(v12-113e3)去除冗余，相似性閾值設(shè)置為95%，覆蓋度閾值設(shè)置為90%。去除冗余后的片段用于構(gòu)建基因目錄，綜合各樣本的有效數(shù)據(jù)得到基因目錄在各樣本中的豐度，將基因目錄與Nr數(shù)據(jù)庫比對，得到每個基因的物種注釋結(jié)果，然后與KEGG(二級水平)、eggNOG數(shù)據(jù)庫比對得到相關(guān)基因的注釋結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

3.1 宏基因組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

測序數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)控、過濾，5份成年雄性海南長臂猿糞便共得到25 883.84 Mb有效數(shù)據(jù)，對應87 131 440條reads。Q20和Q30分別達到97%和93%以上，表明本次測序數(shù)據(jù)有較高可靠性(表2)。

表2 成年雄性海南長臂猿糞便宏基因測序數(shù)據(jù)

3.2 海南長臂猿腸道細菌組成

成年雄性海南長臂猿腸道中優(yōu)勢菌門為厚壁菌門(Firmicutes，(55.78±9.19)%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，(33.13±11.88)%)。此外，放線菌門(Actinobacteria，(3.24±1.46)%)、纖維桿菌門(Fibrobacteres，(2.38±1.07)%)和螺旋體門(Spirochaetes，(1.24±0.80)%)也是相對豐度較高的菌門(圖1A)。優(yōu)勢菌屬為普雷沃菌屬(Prevotella，(23.09±9.68)%)和梭菌屬(Clostridium，(4.12±1.22)%)，擬桿菌屬(Bacteroides，(3.28±0.93)%)、真桿菌屬(Eubacterium，(3.00±0.67)%)和絲狀桿菌屬(Fibrobacter，(2.37±1.06)%)相對豐度次之(圖1B)。

圖1 海南長臂猿腸道細菌在門(A)和屬水平上(B)的相對豐度

3.3 海南長臂猿腸道真菌、古菌和病毒組成

海南長臂猿腸道內(nèi)優(yōu)勢真菌門包括壺菌門(Chytridiomycota，(43.26±11.94)%)、毛霉門(Mucoromycota，(26.64±10.16)%)、子囊菌門(Ascomycota，(18.97±10.83)%)和擔子菌門(Basidiomycota，(8.03±2.46)%)(圖2A)。優(yōu)勢真菌屬包括根孢囊霉屬(Rhizophagus，(26.13±11.29)%)、新美鞭菌屬(Neocallimastix，(11.24±3.14)%)和梨囊鞭菌屬(Piromyces，(10.55±4.39)%)(圖2B)。

圖2 海南長臂猿腸道真菌在門(A)和屬水平上(B)的相對豐度

海南長臂猿腸道內(nèi)主要古菌門為廣古菌門(Euryarchaeota，(84.90±4.07)%)和泉古菌門(Crenarchaeota，(1.60±1.87)%)(圖3A)。在屬水平上，優(yōu)勢古菌屬為甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter，(13.99±1.50)%)，此外甲烷囊菌屬(Methanoculleus，(8.32±1.99)%)、甲烷球形菌屬(Methanosphaera，(8.07±2.65)%)和甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina，(8.01±1.91)%)也是相對豐度較高的古菌屬(圖3B)。

圖3 海南長臂猿腸道古菌在門(A)和屬水平上(B)的相對豐度

海南長臂猿腸道內(nèi)主要病毒種類為肌尾噬菌體科(Myoviridae，(26.90±11.74)%)、長尾噬菌體科(Siphoviridae，(20.71±7.73)%)、微小噬菌體科(Microviridae，(18.28±14.34)%)和短尾噬菌體科(Podoviridae，(5.23±5.86)%)等(圖4)。

圖4 海南長臂猿腸道病毒在科水平上的相對豐度

3.4 海南長臂猿腸道微生物基因功能注釋

基于Unigenes的注釋結(jié)果，繪制KEGG和eggNOG數(shù)據(jù)庫的注釋基因數(shù)目統(tǒng)計圖。去冗余后的預測基因共有579 530個，其中有212 754(36.71%)個基因能夠比對上KEGG數(shù)據(jù)庫，有357 966(61.77%)個基因能夠比對上eggNOG數(shù)據(jù)庫。在KEGG數(shù)據(jù)庫中，主要注釋到的基因功能為新陳代謝(metabolism)、遺傳信息處理(genetic information processing)、環(huán)境信息處理(environmental information processing)和細胞過程(cellular processes)。從功能數(shù)據(jù)上看，注釋到的大部分基因與新陳代謝相關(guān)，如碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)、氨基酸代謝(amino acid metabolism)和核苷酸代謝(nucleotide metabolism)等(圖5A)。基于eggNOG數(shù)據(jù)庫，在已知的基因功能分類中，復制、重組和修復(replication，recombination and repair)類別豐度最高，其次是碳水化合物轉(zhuǎn)運與新陳代謝(carbohydrate transport and metabolism)、細胞壁/膜/包膜生物合成(cell wall/membrane/envelope biogenesis)和氨基酸的轉(zhuǎn)運和代謝(amino acid transport and metabolism)等(圖5B)。

圖5 基于KEGG(二級水平)(A)和eggNOG基因功能分類(B)對非冗余基因集的功能注釋

4 討論

腸道微生物與宿主的健康狀況緊密相關(guān)，靈長類動物與人類的親緣關(guān)系最為接近，研究靈長類動物的腸道菌群組成情況，不僅對深入研究人類腸道菌群有參考價值，對于保護生物學也有重要意義。本研究通過非損傷取樣法，結(jié)合宏基因組測序技術(shù)，首次對成年雄性海南長臂猿的腸道菌群組成進行了測序分析。研究結(jié)果顯示，海南長臂猿腸道中的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門和擬桿菌門，這一結(jié)果與前人對其他非人靈長動物(如黑葉猴和金絲猴等)的腸道菌群研究結(jié)果[13，16]相似。本研究的采樣時間是在旱季，海南長臂猿在旱季食物相對匱乏，能夠取食果實的植物種類減少，且分布不集中，會增加對植物嫩葉和花取食的策略或增加食物的攝入，彌補移動尋食所造成的能量消耗[5]。海南長臂猿腸道中厚壁菌門的相對豐度略高于擬桿菌門，由于厚壁菌門中的大部分細菌能夠?qū)⒗w維素分解為可揮發(fā)性脂肪酸而被宿主利用，而擬桿菌門的主要功能則是降解非結(jié)構(gòu)性碳水化合物和蛋白質(zhì)[17-18]，因此該結(jié)果與海南長臂猿在旱季的食性相對應。腸道中厚壁菌門與擬桿菌門的比例(F/B)會影響宿主獲取能量和吸收營養(yǎng)的能力，厚壁菌門占比的增長與宿主體重增加有明顯的關(guān)聯(lián)[19]，這是因為厚壁菌門中的大部分細菌類群能夠分解復雜的碳水化合物，使從食物中獲取的能量增加[20]。海南長臂猿在旱季腸道中這種較高F/B比例的菌群結(jié)構(gòu)有利于其在食物匱乏的情況下更高效地從食物中吸收營養(yǎng)成分。與其他個體相比，A1和A3這兩只海南長臂猿所在家族群活動范圍較小，分布區(qū)域內(nèi)食物更為豐富，腸道中厚壁菌門與擬桿菌門的比例較為接近，而其他個體需要較高豐度的厚壁菌門來增加能量的獲得。在屬水平上，優(yōu)勢菌屬瘤胃球菌屬、梭菌屬和普雷沃氏菌屬等均能夠幫助海南長臂猿降解樹葉中纖維素和半纖維素等結(jié)構(gòu)性碳水化合物[17，21]，這表明腸道菌群在海南長臂猿的營養(yǎng)消化吸收方面發(fā)揮著重要作用，反映了在動物的進化過程中，腸道菌群組成與動物的食性緊密相關(guān)。

海南長臂猿腸道優(yōu)勢真菌為根孢囊霉屬和新美鞭菌屬。根孢囊霉屬是一種植物共生菌，能夠提高植物抗旱性和對微量元素的獲取[22]，可能是伴隨植物一起進入海南長臂猿的消化道。新美鞭菌屬在宿主對纖維的消化中起到重要作用，這類真菌主要存在于高纖維飲食的動物消化道中，由這種真菌分泌的多糖降解酶能夠?qū)⒃S多不易降解的植物聚合物水解，從而降解非木質(zhì)化的植物細胞壁[23]。海南長臂猿腸道優(yōu)勢古菌屬為甲烷短桿菌屬、甲烷囊菌屬、甲烷球形菌屬和甲烷八疊球菌屬，這些產(chǎn)甲烷古菌廣泛存在于植食性動物的胃腸道中[24-25]，通過消耗氫氣保證消化道正常發(fā)酵的進行，促進纖維素和半纖維素的進一步分解。海南長臂猿腸道中的病毒種類多為肌尾噬菌體、長尾噬菌體、微小噬菌體和短尾噬菌體這類對宿主無害的噬菌體，它們能夠特異性侵染細菌。基因功能注釋的結(jié)果表明，大部分基因與碳水化合物代謝和氨基酸代謝等功能相關(guān)，同樣與海南長臂猿的食性相吻合。

本研究通過宏基因組技術(shù)對雄性成年海南長臂猿的腸道微生物進行了測序分析和功能注釋，對于了解該極危物種的腸道微生態(tài)特征及其功能有重要意義。

致謝：感謝海南霸王嶺林業(yè)局海南長臂猿監(jiān)測隊王進強、鄒正沖、黃盧標、李文永和王超東等工作人員的大力支持和幫助。