糞便顯微分析和DNA宏條形碼技術在野豬食性分析中的應用和比較

宮 爽 張 萍，2 欒 雪，3 包 衡 姜廣順，4*

(1.東北林業大學野生動物與自然保護地學院，哈爾濱，150040；2.南江縣林業局，南江，635600；3.杭州禹創企業服務有限公司，杭州，310000；4.國家林業和草原局貓科動物研究中心，哈爾濱，150040)

有蹄類動物食性研究的精確性與資源管理有直接關系[1]，可評估營養容納量，對種群管理和種間關系等生態學問題探討提供有價值的信息[2-3]。食物選擇性是指動物出于某些目的，對取食生境中存在的食物種類進行選擇，食物選擇的過程與結果是非常復雜的，與食物的豐盛度、形態學特征、氣味、適口性、營養價值及消化生理等因素有關[4-5]。目前，食性分析的方法有很多，主要包括糞便顯微分析法、DNA條形碼分析法、胃分析法、直接觀察法、取食地點檢查法和啃食調查法等[6-11]。

糞便顯微分析法使用范圍比較廣泛[12]，優點是非損傷性取樣，對動物干擾性小，糞便樣品容易收集；缺點是有些植物角質細胞經動物消化后用顯微鏡很難區分辨認，造成糞便中有些采食物種比例增大或減小的情況，制片過程中化學試劑的影響，糞便顯微分析也會出現實際取食比例減少的情形；此外，糞便顯微分析結果會受到鏡檢方法和鏡檢人員對植物角質細胞主觀認知差異等因素的影響。糞便顯微鏡檢方法包括頻率轉換法、點樣方法、直接計數法、面積法與截線法，其中頻率轉換法最節省時間，點樣方法估計效果最好，鏡檢時常選擇這兩種方法[13]。

近些年來，應用DNA條形碼技術分析野生動物食性備受關注[14-15]，優點是工作量小、數據量大、靈敏度高，捕獲出現頻次較低的DNA序列，即較少取食食物也可被定量化；分類更加精細，精確到種級別的分類單元；但缺點是成本高、步驟繁多，不可控因素對分析結果的準確性產生影響，如從糞便樣品中提取的DNA會發生一定程度的降解情況。DNA條形碼長度過長，PCR擴增時效果較差；DNA條形碼長度過短，識別精度又會下降。因地理分布的差異性，DNA分析使用的公共數據庫僅收錄了局部范圍內的部分DNA條形碼，造成了分類精度下降，無法滿足不同區域食性研究的需要[16]。

野豬(Susscrofa)是一種中型哺乳動物，對于環境有很強的適應性，分布廣泛，雜食性物種，在生態系統中處于重要地位。本試驗在區域尺度上利用糞便顯微分析法和DNA宏條形碼技術對野豬植物性食性進行研究，盡可能消除地理因素對食性分析方法統計結果的差異性；通過比較兩種方法的優缺點，明確糞便顯微分析法和DNA宏條形碼技術在食性結果上的差異與一致性，為有蹄類動物食性研究的方法選擇提供方法學依據。

1 研究區概況

選擇琿春東北虎國家級自然保護區、汪清國家級自然保護區、黃泥河國家級自然保護區、天橋嶺林業局和穆棱東北紅豆杉國家級自然保護區作為研究地區，位于長白山北部林區老爺嶺南和張廣才嶺南附近。老爺嶺位于黑龍江省東南部和吉林省東部，為長白山支脈，海拔600～1 000 m，年平均氣溫2.3～3.5 ℃；張廣才嶺位于中國東北地區東部山地北段的中軸部位，是興安嶺山系長白山的支脈，平均海拔約800 m，年平均氣溫2.3～3.7 ℃，植被類型主要為紅松(Pinuskoraiensis)、云杉(Piceaasperata)及闊葉樹組成的針闊混交林和灌叢等。

2 材料與方法

2.1 樣本采集

2014年12月—2016年3月，采用冬季雪地足跡跟蹤方法在琿春、汪清、黃泥河、天橋嶺和穆棱地區，收集野豬新鮮糞便(≤24 h)和可取食食物樣本，每條足跡鏈長度保證在3 km以上。為避免個體重復，每條足跡鏈上收集1～3份糞便樣品，帶回的糞便樣本及時放入冰箱內-20 ℃保存，以便進一步分析。

2.2 糞便顯微分析法

將新鮮的野豬糞便樣本和植物樣本放于檔案袋中，在烘箱里70 ℃烘48 h至恒重后粉碎研磨，粉碎后取小于40目的過篩物且大于100目的篩上物進行后續處理。選取過篩后的糞便樣本或植物樣本約0.5 g放置于培養皿中，加入10%次氯酸鈉溶液，體積約占培養皿體積的2/3，用清洗干凈的鑷子在培養皿中緩慢攪拌，攪拌后浸泡3 h以上，使其充分消化。樣品消化結束后，樣品和消化液一起倒在100目的網篩上，用蒸餾水充分沖洗去除消化液，樣品沖洗干凈后放回干凈的培養皿中準備制片。在載玻片上滴一滴甘油，用鑷子夾取少量樣品放置于載玻片上的甘油中，使樣品分布均勻，將載玻片放在10×10倍的顯微鏡下觀察，確保細胞結構清晰后，蓋上蓋玻片封片，用中性樹膠封邊，再放到物鏡為20倍的顯微鏡下仔細辨認，每種植物樣本制作2～4個裝片在顯微數碼照相機下拍照用于對照辨認。

鏡檢時采用頻率轉換法統計野豬取食物種的組成比例，每個玻片鏡檢的方向為從左向右，從上到下，辨認野豬取食植物種類和記錄每種植物被拍攝的次數。根據頻率轉換公式計算：

F=100(1-e-D)

(1)

D=ln[1/(1-F)]

(2)

DR=D/∑D×100%

(3)

式中：F為每個糞便玻片中每種植物可辨認角質細胞的出現頻率；D為每種植物可識別表皮角質細胞碎片的密度；DR為野豬采食的每種植物實際組成比例的估計值，即野豬主要食物組成比例。

2.3 DNA宏條形碼分析法

從野豬的新鮮糞便中提取采食物種的DNA，糞便的新鮮程度是決定DNA質量的關鍵，利用DNA條形碼食性分析的基本原理是基于糞便中的DNA來自不同取食種類其條形碼區域不同。測序服務由上海派森諾生物科技股份有限公司提供，設計選擇高通用性和高分辨率的DNA條形碼引物，利用PCR技術擴增某段特異性片段，選用引物Z1aF(5′-ATGTCACCACCAACAGAGACTAAAGC-3′)和hp2R(5′-CGTCCTTTGTAACGATCAAG-3′)對食物葉綠體rbcL區擴增，PCR采用NEB Q5 DNA高保真聚合酶0.25 μL，5×Reaction Buffer和5×High GC Buffer各5.00 μL，2.00 μL的dNTP(2.5 mmol/L)，2.00 μL的模板DNA，引物(10 μmol/L)各1.00 μL，8.75 μL的無核酸水。PCR反應程序：98 ℃預變性2 min；98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個循環；72 ℃延伸5 min。

PCR擴增產物用Agencourt AMPure Beads試劑盒(貝克曼庫爾特有限公司)純化回收，使用PicoGreen dsDNA Assay Kit(美國英杰生命技術有限公司)進行定量。定量步驟完成后，采用雙端測序法(paired-end sequencing)，由Illumina MiSeq系統(上海派森諾生物科技股份有限公司)完成測序，測序結果進行序列拼接、清除冗余序列、降噪和序列分類等步驟，完成序列整理與分析，經過篩選和數據庫對比DNA測序序列，通過序列的相似性判斷對應的食物種類，判斷物種的標準為：對比結果一致度不低于97%時，最匹配序列只對應單一的植物物種，該物種在當地有分布時，認為序列來自該物種；如最匹配序列對應多個植物物種，需要排除在當地沒有分布的物種，如仍對應不止一種，則鑒定結果即包含這些物種的最小分類單元。

根據高通量測序得出的食物DNA序列數，定量野豬取食物種所占比例。DNA條形碼數據庫構建步驟：在目標動物的覓食地區，收集可能被取食食物物種的組織材料，提取這些物種的DNA合成相應的引物，創建潛在食源DNA條形碼的數據庫。

2.4 數據的統計分析

食物多樣性分析采用物種豐富度指數(D)，Shannon-Wiener指數(H′)，均勻度指數(J′)，生態位寬度(B)，計算公式如下：

D=(S-1)/lnN

(4)

(5)

J′=H′/lnS

(6)

(7)

式中：S為野豬某糞便樣品中物種總數目；N為野豬某糞便樣品中包含的所有物種總個體數目；Pi為野豬某糞便樣品中植物i在這份糞便所占的比例。

使用SPSS軟件進行兩獨立樣本Mann-WhitneyU檢驗，比較糞便顯微分析和DNA宏條形碼技術在不同地區的物種豐富度指數、Shannon-Wiener指數、均勻度指數和生態位寬度的差異，P<0.05為差異顯著。

3 結果與分析

3.1 野豬食性組成對比

在5個研究地區，共采集117份野豬新鮮糞便，其中琿春33份、汪清33份、黃泥河18份、天橋嶺17份和穆棱16份。糞便樣本中分離鑒定出的食物種類有枝條、芽、葉、果實、樹皮、莖、根、草本、苔蘚、其他(石頭等)及動物組織。采用糞便顯微分析方法，鑒定出的植物種類主要有薹草屬(Carex)、松屬(Pinus)、木賊屬(Equisetum)、柳屬(Salix)、楊屬(Populus)、榆屬(Ulmus)、槐屬(Sophora)、榛屬(Corylus)、櫟屬(Quercus)、槭屬(Acer)、忍冬屬(Lonicera)、梾木屬(Swida)、衛矛屬(Euonymus)、五加屬(Acanthopanax)、丁香屬(Syringa)、稠李屬(Padus)、花楸屬(Sorbus)、椴樹屬(Tilia)、胡桃屬(Juglans)、蘋果屬(Malus)、榿木屬(Alnus)、樺木屬(Betula)、杜鵑花屬(Rhododendron)、越桔屬(Vaccinium)、溲疏屬(Deutzia)、胡枝子屬(Lespedeza)、獼猴桃屬(Actinidia)、繡線菊屬(Spiraea)、珍珠梅屬(Sorbaria)、落葉松屬(Larix)、蹄蓋蕨屬(Athyrium)和鱗毛蕨屬(Dryopteris)32屬。

采用糞便顯微分析方法獲得的食性結果中，總體上，比例大于4%的主要食物有木賊屬(22.76±1.87)%、松屬(22.56±1.73)%、薹草屬(25.41±2.09)%和苔蘚(Bryophyta，(4.95±1.02)%)。對每個地區采食植物相對密度大于4%的主要食物進行分析，其中在琿春地區，薹草屬(38.92±4.76)%、松屬(8.70±1.11)%、木賊屬(8.63±2.09)%、苔蘚(7.22±2.35)%、槭屬(5.26±1.06)%和忍冬屬(3.41±0.61)%是野豬的主要食物；在汪清地區，薹草屬(39.9±4.53)%、松屬(12.53±2.13)%、苔蘚(9.91±2.95)%、忍冬屬(6.58±1.61)%和槭屬(5.38±1.56)%是野豬的主要食物；在黃泥河地區，松屬(41.48±5.02)%、木賊屬(34.25±4.30)%和薹草屬(8.88±1.67)%是野豬的主要食物；在天橋嶺地區，木賊屬(41.95±2.53)%、松屬(25.94±2.73)%、薹草屬(13.69±1.66)%和蕨類(Pteridophyta，(6.13±1.03)%)是野豬的主要食物；在穆棱地區，木賊屬(41.40±3.94)%、松屬(39.19±5.00)%和薹草屬(9.67±1.24)%是野豬的主要食物。

從琿春、汪清、黃泥河、天橋嶺和穆棱5個地區各取4份野豬糞便進行DNA宏條形碼技術分析，鑒定出的植物種類有薹草屬、胡桃屬、唐菖蒲屬(Gladiolus)、櫟屬、牛蒡屬(Arctium)、榿木屬、蚊子草屬(Filipendula)、槐屬、樺木屬、榛屬、獼猴桃屬、落花生屬(Arachis)、槭屬、木賊屬、繡線菊屬、珍珠梅屬、落葉松屬、松屬、衛矛屬、楊屬、榆屬、唐松草屬(Thalictrum)、鵝耳櫪屬(Carpinus)、扁果草屬(Isopyrum)、桑屬(Morus)、李屬(Prunus)、黃瓜屬(Cucumis)、早熟禾屬(Poa)、天仙子屬(Hyoscyamus)、鹿蹄草屬(Pyrola)、稻屬(Oryza)、冷杉屬(Abies)、鐵線蓮屬(Clematis)、百合屬(Lilium)、蠅子草屬(Silene)、刺槐屬(Robinia)、臭草屬(Melica)、蕁麻屬(Urtica)、梣屬(Fraxinus)、鐵木屬(Ostrya)、黃檗屬(Phellodendron)、懸鉤子屬(Rubus)、鳶尾屬(Iris)、委陵菜屬(Potentilla)、針藺屬(Trichophorum)、仙女木屬(Dryas)、旋覆花屬(Inula)、擬耬斗菜屬(Paraquilegia)、云杉屬(Picea)、柞木屬(Xylosma)、茄屬(Solanum)、蒿屬(Artemisia)、銀蓮花屬(Anemone)、栒子屬(Cotoneaster)、花椒屬(Zanthoxylum)、山琉璃草屬(Eritrichum)、黍屬(Panicum)、薔薇屬(Rosa)、紫穗槐屬(Amorpha)和荸薺屬(Heleocharis)60屬。

采用DNA宏條形碼技術獲得的食性結果中，總體上，比例大于4%的主要食物有薹草屬(30.02±5.95)%、唐菖蒲屬(18.76±4.12)%、胡桃屬(6.63±3.84)%、蚊子草屬(5.23±2.79)%、榛屬(4.23±1.60)%和繡線菊屬(4.93±4.06)%。對每個地區采食植物相對密度大于4%的主要食物進行說明，其中在琿春地區，薹草屬(49.65±17.67)%、胡桃屬(28.45±21.29)%、唐菖蒲屬(4.88±1.53)%、蚊子草屬(4.43±3.92)%和櫟屬(4.12±3.04)%是野豬的主要食物；在汪清地區，薹草屬(47.70±25.09)%、唐菖蒲屬(24.00±11.40)%、槭屬(5.30±4.93)%、落花生屬(5.23±5.21)%、榛屬(4.96±4.92)%和胡桃屬(4.09±4.08)%是野豬的主要食物；在黃泥河地區，唐菖蒲屬(29.17±8.76)%、薹草屬(21.62±4.78)%、槭屬(7.76±2.89)%、榛屬(7.60±3.81)%、木賊屬(7.19±3.77)%、櫟屬(5.50±2.63)%和鵝耳櫪屬(4.34±3.78)%是野豬的主要食物；在天橋嶺地區，蚊子草屬(22.98±13.95)%、薹草屬(16.87±11.65)%、牛蒡屬(9.20±6.56)%、扁果草屬(6.91±4.21)%、唐松草屬(6.74±6.64)%、落花生屬(4.82±2.80)%、桑屬(4.53±2.79)%、繡線菊屬(4.49±2.63)%和唐菖蒲屬(4.47±2.71)%是野豬主要食物；在穆棱地區，繡線菊屬(24.39±24.36)%、薹草屬(22.69±9.57)%、唐菖蒲屬(20.89±8.24)%和落花生屬(12.24±4.56)%是野豬主要食物(圖1)。

圖1 糞便顯微分析和DNA宏條形碼技術獲得的野豬食物組成

3.2 野豬食物多樣性指數和生態位寬度

通過糞便顯微分析和DNA宏條形碼技術，探究冬季野豬在琿春、汪清、黃泥河、天橋嶺和穆棱地區的食物物種豐富度、多樣性、均勻度指數及生態位寬度差異。由糞便顯微分析和DNA宏條形碼技術分析預測的野豬食性計算得到的物種豐富度指數(圖2A)，琿春、汪清和穆棱地區糞便顯微分析得到的野豬食物物種豐富度顯著高于DNA宏條形碼技術分析得到的野豬食物物種豐富度(P<0.05)；Shannon-Wiener指數(圖2B)：黃泥河地區糞便顯微分析得到的野豬Shannon-Wiener指數顯著低于DNA宏條形碼技術分析得到的野豬Shannon-Wiener指數(P<0.05)；均勻度指數(圖2C)：琿春地區糞便顯微分析得到的野豬食物的均勻度指數顯著高于DNA宏條形碼技術分析得到的野豬食物的均勻度指數(P<0.05)；生態位寬度(圖2D)：黃泥河地區糞便顯微分析得到的野豬食物的生態位寬度顯著低于DNA宏條形碼技術分析得到的野豬食物的生態位寬度(P<0.05)。

圖2 野豬食物多樣性指數和生態位寬度

4 討論

食性分析可為研究動物生存現狀、營養狀況和種間關系提供資料[17-22]。有蹄類食性分析通常采用糞便顯微分析法，該方法對動物具有非損傷性，樣品收集和保存十分方便。近年來，DNA宏條形碼技術在食性分析中逐漸成熟和穩定，隨著測序技術的不斷發展，在有蹄類食性研究領域的使用更加廣泛[23-25]。本研究通過糞便顯微分析法和DNA宏條形碼技術獲得野豬主要食物種類和比例不同的情況。DNA宏條形碼技術可以分析野豬的動物性食物，而糞便顯微分析法無法分析野豬的動物性食物種類，因此，本研究未分析野豬動物性食物，僅對植物性食物對比研究。兩種方法獲得結果存在差異的主要原因可能無法確保糞便顯微分析法的精準性。有一些學者認為，由于一些物種在種的級別難以區分表皮細胞特征差異，甚至有一些物種在屬的級別也難以區分，動物本身消化作用也會對辨認度產生影響，這些因素均對食性分析結果造成影響[26-28]。本研究支持這一論點，通過糞便顯微分析方法分析野豬食性，由于有些物種表皮細胞難以辨別，可能會出現食物類別鑒定不夠全面乃至比例有變化的情況，如槭屬和榛屬的表皮細胞相似，又如櫟屬和樺木屬的表皮細胞相似，這將增加辨認的難度。DNA宏條形碼技術靈敏性較高，能識別出較少取食物種的DNA，使得食性分析更全面[29-31]，但也可能出現同種食物中不同細胞的DNA拷貝數存在差異，及不同食物DNA模板的PCR擴增效率存在差異等情況，造成測序產生的DNA序列數較多的食物，有可能野豬取食較少，序列數少的卻有可能是野豬的主要食物[32]；DNA宏條形碼技術需要構建潛在食源DNA條形碼數據庫，而現有的公共數據庫中種類不全，只有局部范圍的物種DNA條形碼，可能無法滿足食性分析的需要[33-37]。

本研究中通過糞便顯微分析和DNA宏條形碼技術分析獲得的野豬食物類別不一致，及同一食物所占比例不同的情況，或是由于上述原因造成的。糞便顯微分析結果顯示5個地區野豬共取食32屬植物，主要取食薹草屬、松屬、木賊屬和苔蘚；DNA宏條形碼技術分析結果顯示5個地區野豬共取食60屬植物，主要取食薹草屬、胡桃屬、唐菖蒲屬、蚊子草屬、榛屬和繡線菊屬。顯然，DNA宏條形碼技術可辨認的食物類別會更全面，表明DNA宏條形碼技術在定性分析食物類別上優于糞便顯微分析。

糞便顯微分析和DNA宏條形碼技術都是使用動物糞便進行分析。使用糞便顯微分析時，需盡可能采集動物活動范圍內可利用的植物樣本，通過與已知的植物角質細胞結構對比，更準確地確定糞便中食物種類和比例；使用DNA宏條形碼技術時，需將獲得的物種DNA序列與資源數據庫內收錄的物種DNA條形碼進行對比判斷種屬，為避免資源數據庫收錄的物種DNA條形碼不足，需要盡可能全面地建立動物潛在食源DNA條形碼數據庫。因此，糞便顯微分析和DNA宏條形碼技術兩種方法存在一致性，均需要充分采集環境中可食用植物樣本，建立全面的可食用植物角質細胞或DNA序列數據庫，才可能獲得精準的食性分析結果。

在歐洲和北美洲的森林中，野豬主要采食橡子、栗子、草本植物的地上部位和少許地下的根等，草本類植物占比較大，在資源匱乏的季節，野豬食物選擇更多樣化[38]；宋軍等[39]在遼寧白石砬子保護區通過調查發現野豬主要采食蒙古櫟(Quecusmongolica)果實、山葡萄(Vitisamurensis)果實、五味子(Schisandrachinensis)果實、玉蜀黍(Zeamays)和大豆(Glycinemax)等植物；王文等[40]在黑龍江通河烏龍狩獵場采用糞便顯微分析法確定野豬主要食物種類為木賊(Equisetumhiemale)、紅松、胡桃楸(Juglansmandshurica)、蒙古櫟、稠李(Padusracemosa)、榛(Corylusheterophylla)、薹草和遼東楤木(Araliaelata)。本研究根據糞便顯微分析法得出的野豬取食主要食物，和上述幾個研究得出的野豬主要食性有部分相同，即野豬主要取食木賊、紅松和薹草等物種，喜歡采食有果實類植物和草本類植物。由于野豬生活覓食地理環境不同，采食植物種類也會表現出一些差異，如在韓國雪岳山國立公園采用DNA條形碼技術分析得知野豬主要取食薔薇科(Rosaceae)和苔蘚類植物，其中薔薇科主要包括地榆屬(Sanguisorba)、蚊子草屬和李屬[41]；而在美國3個州采用糞便DNA分析發現野豬主要采食殼斗科(Fagaceae)、莧科(Amaranthaceae)、禾本科(Poaceae)、菊科(Asteraceae)、傘形科(Umbelliferae)、柏科(Cupressaceae)、柳葉菜科(Onagraceae)、蓼科(Polygonaceae)、大麻科(Cannabaceae)和大戟科(Euphorbiaceae)等植物[42]。本研究根據DNA分析法得出的野豬采食種類數量較多，與上述兩個野豬食性研究結果相似，都采食豐富的草本類植物。此外，野豬是機會主義雜食動物，飲食很大程度上取決于不同食物類型的相對可用性，不同季節野豬的食物選擇也會發生變化[43]。在法國東南部的一個山谷中，野豬春季最重要食物是植物的綠色部分、根系和玉蜀黍，夏季以根莖和肉質果實為主，秋季以水果為主，冬季以肉質水果為主[44]，與本研究中野豬冬季食性有一定相似，都喜歡取食果實類植物物種。

基于上述結果，本研究認為采用糞便顯微分析可能得出物種較少，尤其是草本類植物較少；而采用DNA宏條形碼技術可能得出物種較多，尤其是草本類植物種類較多。因此，在分析有蹄類動物食性時，使用糞便顯微分析法應收集全面的可食用植物的角質細胞結構，包括灌木、草本、苔蘚和果實類，以便充分對照樣本，減少辨認誤差。使用DNA宏條形碼技術時，應盡量豐富本地可利用食物的DNA條形碼數據庫，避免基礎數據庫和研究動物出現地域差異，從而對了解自然條件下食物種類和比例造成不利影響。