香附烯酮與卡鉑聯合應用對三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231增殖、凋亡的影響及其機制

趙威，于志勇

1 山東第一醫科大學（山東省醫學科學院）研究生部，濟南 250117；2 山東省腫瘤醫院乳腺外科

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，三陰性乳腺癌（TNBC）占乳腺癌10%～20%［1］。與其他亞型相比，TNBC 缺乏內分泌及靶向治療機會，預后較差。鉑類是TNBC 常用化療藥物，但由于化療抵抗性和較大的不良反應，限制了它的使用［2］。因此，尋求新的治療方案已成為醫務工作者的當務之急。香附是一種傳統中藥，現代藥理研究［3］發現，香附具有一定的抗腫瘤作用。此前，我們的課題組已證實香附乙醇提取物對TNBC 細胞具有細胞毒作用［4］，還進一步通過抗腫瘤活性實驗證實香附的主要活性成分為香附烯酮，但其抗癌潛在機制以及與卡鉑聯合抗癌作用尚缺乏報道。有文獻［5］報道，鉑類化療藥殺滅腫瘤細胞的其中一個機制是激活了內質網應激通路，而外源內質網信號途徑是誘導細胞凋亡的3個常見通路之一［6］。內質網負責跨膜蛋白質的成熟和正確折疊，化療藥物的干預可引起外環境缺氧和營養缺乏，致使蛋白質折疊環境受損，最終導致內質網腔內未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白的積累，引起內質網應激。RNA 活化蛋白激酶樣內質網激酶（RNA-activated protein kinase（PKR）-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）是內質網跨膜信號轉導器，錯誤折疊蛋白的聚集可引起PERK 的活化，進一步激活轉錄因子4（ATF4），以阻斷錯誤折疊蛋白的合成，從而減輕內質網的負擔，維持細胞穩態。但當內質網應激過度發生時，ATF4 可上調C/EBP 同源蛋白（CHOP），啟動內質網介導的凋亡信號來誘導細胞凋亡的發生，清除受損的細胞［7］。2021 年1 月6 日—8 月28 日，本研究觀察了香附烯酮與卡鉑聯合應用對三陰性乳腺癌細胞株MDAMB-231 增殖、凋亡的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 香附烯酮、卡鉑、細胞株及試劑 香附烯酮（C15H22O）購自成都埃法生物科技有限公司。將香附烯酮粉末溶解在二甲基亞砜中（DMSO），配置成100 mmol/L 濃度儲存于-20 ℃。卡鉑購自大連美倫生物公司，將卡鉑粉末溶解在二甲基亞砜中，配置成100μmol/L濃度，儲存在-20 ℃備用。三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231購買于中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫，細胞培養在高糖DMEM 中，上述培養基還加入50 mL 10%胎牛血清和5 mL 100單位/mL青霉素和鏈霉素，在37 ℃和5%CO2的培養箱中培養。CCK-8 試劑盒購自上海碧云天生物公司，兔抗人GAPDH、BAX、Bcl-2、PERK、CHOP、抗兔IgG二抗均購自美國CST公司。

1.2 各組細胞增殖能力觀察

1.2.1 各組細胞存活率測算 采用CCK-8 法。取對數期生長的MDA-MB-231細胞以8 000個/孔的密度接種于96 孔板中，每孔加入100μL 培養基，當細胞生長至融合度75%左右時，分為單純細胞組、卡鉑處理組、香附烯酮處理組、香附烯酮聯合卡鉑組。單純細胞組加入DMSO，卡鉑處理組加入20μmol/L濃度的卡鉑，香附烯酮處理組加入0.4 mmol/L 濃度的香附烯酮，香附烯酮聯合卡鉑組加入20 μmol/L濃度的卡鉑和0.4 mmol/L 濃度的香附烯酮。置于37 ℃恒溫培養箱中繼續培養24 h 后，按照說明書加入CCK-8 試劑，繼續孵育2 h，使用SpectraMax i3 酶標儀測量各組450 nm 處的吸光度值，以空白孔為空白組，計算細胞存活率。細胞存活率＝（各組吸光度值-空白組吸光度值）/（單純細胞組吸光度值-空白組吸光度值）×100%。

1.2.2 各組細胞克隆能力觀察 采用細胞克隆實驗。將MDA-MB-231 細胞接種于6 孔板中，每孔接種600個細胞，每孔加入2 mL 培養基，待細胞貼壁后按“1.2.1”分組方法分別加入藥物處理，置于37 ℃培養箱中繼續培養2 周，棄掉舊培養基，加2 mL 的4%多聚甲醛固定30 min，PBS 沖洗兩次，然后加入2 mL 的1%結晶紫染色30 min，PBS 沖洗兩遍，自然晾干后，使用凝膠成像儀進行拍照并觀察＞50個細胞的細胞集落，計數細胞集落數。以細胞集落數表示細胞克隆能力。

1.3 各組細胞周期分布情況觀察 采用流式細胞術。取MDA-MB-231細胞，按“1.2.1”分組方法分組后繼續培養24 h，收集在15 mL 離心管中，加入2 mL的70%的乙醇，置于4 ℃冰箱中固定72 h，PBS 沖洗2 遍，每組加入300 mL PI 染料，避光孵育30 min，使用流式細胞儀檢測各組細胞周期，并使用Modfit LT軟件計算各組細胞G0/G1期、S期以及G2/M期所占比率。

1.4 各組細胞凋亡率測算 采用流式細胞術。取MDA-MB-231 細胞，按“1.2.1”分組方法分組后繼續培養24 h，收集在15 mL 離心管中，并每管加入5μL Annexin V FITC 和5 μL PI 染液，每組細胞再加入100μL結合緩沖液，避光孵育30 min，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，使用FlowJo V10 軟件計算各組細胞凋亡率。

1.5 各組細胞內質網應激相關蛋白PERK、CHOP和凋亡相關蛋白BAX、Bcl-2 檢測 采用Western Blotting 法。取MDA-MB-231 細胞，按“1.2.1”分組方法分組后繼續培養24 h，置于冰上，棄掉培養基，PBS 沖洗兩次，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA 強裂解液（1∶50），使用1 mL槍頭刮取細胞蛋白，4 ℃條件下12 000 r/min 離心20 min，收取上清液的總蛋白，并按照說明書要求對上清液進行BCA 定量。取蛋白樣品加入5×上樣緩沖液（1：4），然后于100 ℃金屬浴中加熱5 min，自然冷卻后儲存在-20 ℃備用。使用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，常溫下用5%脫脂牛奶將PVDF 膜在搖床上封閉1 h，1×TBST 洗PVDF 膜4 次，每次10 min，剪切目的蛋白對應的PVDF 膜，用PERK、CHOP、Bcl-2、BAX、GAPDH（使用一抗稀釋液1∶1 000 進行稀釋后）等一抗在4 ℃中孵育過夜。次日用TBST 洗滌PVDF 膜4 次后，用辣根過氧化物酶標記的二抗在搖床上孵育1 h，最后將ECL A 液和B液按1∶1配制的發光液均勻滴在PVDF膜上，使用凝膠成像儀獲取相應蛋白圖像，并使用Image J 軟件計算各組灰度值，以灰度值表示各組PERK、CHOP、Bax、Bcl-2蛋白的相對表達量。

1.6 統計學方法 采用SPSS25.0 統計軟件。計量資料呈正態分布時以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞增殖能力比較

2.1.1 各組細胞存活率比較 單純細胞組、卡鉑處理組、香附烯酮處理組、香附烯酮聯合卡鉑組細胞存活率分別為96.45% ± 3.12%、49.27% ± 2.37%、52.91% ± 1.98%、30.13% ± 3.04%，其中卡鉑處理組、香附烯酮處理組細胞存活率相比，P＞0.05，其余組間相比，P均＜0.05。

2.1.2 各組細胞克隆能力比較 單純細胞組、卡鉑處理組、香附烯酮處理組、香附烯酮聯合卡鉑組細胞集落數分別為（328 ± 18）、（204 ± 10）、（138 ± 13）、（47±5）個，組間相比，P均＜0.05。

2.2 各組細胞周期分布情況比較 各組細胞周期分布情況比較見表1。由表1 可知，卡鉑處理組將MDA-MB-231細胞周期阻滯在G2/M期，香附烯酮處理組將MDA-MB-231 細胞周期阻滯在G0/G1 期，香附烯酮聯合卡鉑組細胞G2/M 期和G0/G1 期均發生阻滯。

表1 各組細胞周期分布情況（±s）

表1 各組細胞周期分布情況（±s）

注：與單純細胞組相比，*P＜0.05；與卡鉑處理組相比，#P＜0.05；與香附烯酮處理組相比，△P＜0.05。

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2.3 各組細胞凋亡率比較 單純細胞組、卡鉑處理組、香附烯酮處理組、香附烯酮聯合卡鉑組細胞凋亡率 分 別 為1.49% ± 0.07%、33.45% ± 1.46%、33.73% ± 1.38%、64.23% ± 1.00%，其中卡鉑處理組、香附烯酮處理組細胞凋亡率相比，P＞0.05，其余組間相比，P均＜0.05。

2.4 各組細胞中PERK、CHOP、Bax、Bcl-2蛋白相對表達量比較 各組細胞中Bcl-2、Bax、PERK、CHOP蛋白相對表達量比較見表2。由表2可知，與單純細胞組相比，卡鉑處理組、香附烯酮處理組細胞中PERK、CHOP、Bax 蛋白相對表達量顯著升高，Bcl-2蛋白相對表達量顯著降低（P均＜0.05）；與其它三組相比，香附烯酮聯合卡鉑組細胞中PERK、CHOP、Bax 蛋白相對表達量均顯著升高，Bcl-2 蛋白相對表達量均顯著降低（P均＜0.05）。

表2 各組細胞中PERK、CHOP、Bax、Bcl-2蛋白相對表達量比較（±s）

表2 各組細胞中PERK、CHOP、Bax、Bcl-2蛋白相對表達量比較（±s）

注：與單純細胞組相比，*P＜0.05；與卡鉑處理組相比，#P＜0.05；與香附烯酮處理組相比，△P＜0.05。

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3 討論

目前，TNBC 化療耐受機制仍然未完全闡明，以往研究揭示的可能機制概括起來主要涉及以下4種：①膜糖蛋白介導途徑：包括P-糖蛋白和乳腺癌多藥耐藥相關蛋白；②DNA 修復功能異常：以鉑類等為代表的化療藥物主要通過直接損傷DNA 進而抑制細胞分裂，而腫瘤細胞DNA 修復系統活性異常升高，將使腫瘤細胞對以上藥物產生耐藥；③凋亡功能的缺失：細胞凋亡是化療藥物主要殺傷腫瘤細胞的途徑，但乳腺癌細胞內源性或獲得性的凋亡相關基因（Bcl-2基因）異常表達或功能缺陷，可造成腫瘤細胞對藥物介導凋亡的抵抗，從而使化療耐藥；④微環境耐藥：腫瘤微環境通過調節耐藥基因表達，從而影響化療藥物的敏感性［8-11］。

近年來的研究［12-14］表明，以非傳統乳腺癌藥物靶點為導向的特異性針對雄激素受體的內分泌抑制劑和針對表皮生長因子受體（EGFR）及血管內皮生長因子（VEGF）的靶向酪氨酸激酶抑制劑、程序性死亡受體（PD-1）及其配體PD-L1的免疫檢查點抑制劑在內的新型治療策略在TNBC 治療方面取得一定程度上的進展，其與標準化療方案的聯合無疑會為提高療效、改善預后以及減輕不良反應帶來潛在應用前景，但相關研究仍處在臨床試驗初期，真正進入臨床實踐階段尚需更多循證依據。因此，以化療為基本研究切入點，聯合新型治療藥物優化傳統單一化療策略，進而改變腫瘤細胞生長的微環境，避免耐藥的產生，最終實現“協同抑瘤，優勢最大”是目前TNBC治療當務之急。

中醫藥是一個極具潛力的寶庫，有著數千年的文化積淀。香附（莎草科）在傳統醫學中被廣泛用于治療包括癌癥在內的各種疾病［15］。我們團隊通過查閱中醫文獻，發現香附外敷可治療乳巖，隨后團隊采用UPLC-Q-TOF-MS 檢測香附乙醇提取物的化學成分。體外研究發現，香附乙醇提取物以劑量依賴性抑制TNBC 細胞增殖，其機制可能與阻滯細胞周期于G0/G1 期有關，并誘導TNBC 細胞凋亡［4］。近年來研究［16-17］發現，香附提取物對卵巢癌、結腸癌、肝癌、肺癌等各類腫瘤細胞的增殖均能夠顯著抑制，呈現廣譜的抗腫瘤活性。

本研究通過細胞毒性實驗證實了香附烯酮可抑制MDA-MB-231細胞增殖能力，當與卡鉑聯用時，可進一步抑制MDA-MB-231 細胞增殖和克隆，表明香附烯酮可增強MDA-MB-231 細胞對卡鉑的敏感性。使用流式細胞儀對細胞周期的評估顯示，香附烯酮聯合卡鉑處理后，MDA-MB-231 細胞G0/G1 期及G2/M期均發生不同程度阻滯。

凋亡的缺失被認為是腫瘤進展的標志之一，而促進凋亡則是癌癥治療的重要靶點。我們的研究發現，香附烯酮聯合卡鉑可進一步增加MDA-MB-231細胞凋亡率，同時上調了凋亡標志蛋白Bax 蛋白表達，并下調了抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表達水平。內質網應激是介導外源性凋亡的重要途徑，PERK/CHOP 介導的內質網應激是細胞外源性凋亡的一個常見途徑［18-19］。Western Blotting 實驗結果顯示，香附烯酮可上調內質網應激相關蛋白PERK、CHOP 的表達，與卡鉑聯合應用時，可進一步增強香附烯酮的作用，提示香附烯酮可能通過PERK/CHOP 介導的內質網應激增強卡鉑對MDA-MB-231 細胞的毒性作用。

綜上所述，香附烯酮聯合卡鉑可抑制三陰性乳腺癌細胞的增殖，促進其凋亡，其機制可能與調節內質網應激介導的細胞凋亡途徑有關。本研究初步證實了香附烯酮通過PERK/CHOP 內質網應激途徑介導的細胞凋亡發揮抗腫瘤作用，并且可增加MDA-MB-231 細胞對卡鉑的敏感性。該研究為三陰性乳腺癌的治療開辟了新的思路，香附烯酮有望成為三陰性乳腺癌治療的重要選擇。