DNA甲基化及其在結直腸癌中的研究進展

馬曉陽 ，江澤友

1 自貢市第四人民醫院檢驗科，四川自貢 643000；2 四川衛生康復職業學院；3 成都中醫藥大學附屬醫院檢驗科

結直腸癌是全世界第三大常見的惡性腫瘤，全球每年約有60萬人死于結直腸癌［1］。結直腸癌多見于北美、歐洲等經濟發達地區，與高蛋白、高脂肪、高糖及低纖維飲食密切相關。隨著發展中國家的發展，預計 2035 年結直腸癌新發病例將達到 250 萬［2］。在我國，由于近年來社會經濟快速發展、人口老齡化、居民生活方式及飲食結構的改變，結直腸癌的發病率及病死率逐年上升，其發病人群呈年輕化趨勢［3］。結直腸癌起源于結直腸黏膜上皮和腺體，根據病理特征將其發生分為經腺瘤癌變序列和鋸齒狀病變通路兩種途徑［4］。細胞內核心調控通路分子表達異常或結構異常使細胞生長代謝功能紊亂，促使正常腸黏膜轉化為腸腺瘤或腸息肉，而后隨著異常分子的逐漸累積發展為結直腸癌。分子異常由遺傳學改變或表觀遺傳學改變引起，二者單獨作用或相互依賴促進細胞癌變。常見的表觀遺傳學改變有DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑以及非編碼RNA 調控。隨著基因組學和表觀遺傳學的深入研究，DNA甲基化與腫瘤的關系成為研究熱點。現就DNA甲基化在結直腸癌中的最新研究進展綜述如下。

1 DNA甲基化概述

DNA 甲基化是一種共價修飾，指DNA 甲基轉移酶（DNMT）將S-腺苷甲硫氨酸（SAM）提供的甲基基團 轉 移 到 DNA 上 。DNMT 有 DNMT1、DNMT3a 和DNMT3b 三種。DNMT1 是一個維持性甲基轉移酶，與DNA 復制過程相偶聯催化子鏈DNA 甲基化，使之獲得與親鏈DNA 相同的甲基化模式。DNMT1 使基因組甲基化模式得以穩定遺傳。而DNMT3a 和DNMT3b 具有從頭合成甲基化活性，催化生成新的甲基化位點，在甲基化模式的建立和重構方面發揮重要作用。DNA 甲基化的逆過程，即DNA 去甲基化，并非甲基化過程的簡單逆轉，而是涉及多個調控過程的生物學行為。TET 是一種依賴α-酮戊二酸（2-OG）和 Fe2+的雙加氧酶家族，有 TET1、TET2 和TET3 三種亞型。該家族可將5-甲基胞嘧啶（5mC）依次氧化為5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）、5-甲酰基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC）［5］。5mC、5hmC、5fC和5caC可干擾DNMT1在DNA復制過程中的甲基化維持功能，使5mC 含量在DNA 復制期間被稀釋，從而導致甲基化程度降低［6］。該過程稱為DNA 被動去甲基化，也稱為依賴DNA 復制的去甲基化。同時，5fC 和5caC 可被胸腺嘧啶糖苷酶（TDG）切除，然后通過堿基切除修復（BER）機制使之被未甲基化的胞嘧啶取代［7］。該過程稱為DNA 主動去甲基化，亦稱為不依賴DNA 復制的去甲基化。研究表明，細胞中的TET 大多通過DNA 被動去甲基化使DNA 甲基化程度降低［6］。DNA甲基化是目前哺乳動物中研究最廣泛和最常見的表觀遺傳學改變。

DNA 甲基化在調節和重編程基因表達模式中起關鍵作用，涉及細胞的多個生理過程如基因沉默、基因印跡、X 染色體失活以及細胞內特異性表達程序的建立和維持。DNA 甲基化通常發生在CpG 二核苷酸胞嘧啶的第5位碳原子上，形成5mC［8］。DNA堿基有A、T、G、C，二核苷酸的組成方式有16種。按照隨機分配原則，CpG 的頻率約為6%，然而CpG 實際頻率只占預測頻率的5%～10%。這是因為基因組中CpG 常處于甲基化狀態（5mCpG），而5mC 穩定性差，常自發性脫氨轉換為T堿基。因此，5mCpG轉換為TpG（互補鏈上為CpA）的特征，導致CpG 的實際頻率低于預測頻率，TpG 和CpA 的實際頻率高于預測頻率。哺乳動物基因組中存在約15%的CpG 分布不均勻，成簇出現形成CpG 島（CGI）。CGI通常位于基因的5′區域（啟動子區域、非翻譯區和1號外顯子區），這些區域的CpG 可參與基因的轉錄調控過程。正常情況下，除了女性不活躍的X染色體、印跡基因以及某些僅在生殖細胞表達基因的CGI，其他區域的CGI 均處于未甲基化狀態。而基因體區域（DNA 編碼區和內含子區）的CpG 含量較低，呈隨機散在分布，且通常處于甲基化狀態。

DNA 啟動子甲基化通過影響基因轉錄和染色體構型而調控基因的表達，主要有以下機制導致基因失活［9］：①DNA 甲基化可直接干擾轉錄因子與含CpG殘基序列的轉錄因子結合位點結合。如轉錄因子激活蛋白2（AP-2）、環磷酸腺苷效應元件結合蛋白（CREB）、E2啟動子結合因子（E2F）和核轉錄因子κB（NF-κB）能識別含 CpG 殘基的序列。②甲基化CpG結合結構域（MBD）蛋白家族是一組含有MBD結構的序列特異性的DNA結合蛋白，靶序列為5mCpG。MBD蛋白與DNA結合后可間接阻止轉錄因子與啟動子形成轉錄復合體。甲基化CpG 結合蛋白2（MeCP2）是第一個被發現的含有MBD 蛋白質，其核心是含有70個氨基酸的MBD結構。目前，已鑒定出11個含有MBD結構的蛋白質，包括MeCP2、MBD1-6、SETDB1-2、TIP5/BAZ2A 和 BAZ2B［10］。③MBD 蛋白與DNA 結合后可招募DNMT、組蛋白去乙酰化酶（HDAC）和染色質重塑因子，促進染色質的構象發生改變從而導致染色質凝縮成致密的非活性結構。

正常細胞的甲基化模式為基因組整體高甲基化和特定基因啟動子區CGI 低甲基化，腫瘤細胞的甲基化模式為基因組整體低甲基化和特定基因啟動子區CGI高甲基化。基因組整體低甲基化通常是由于重復性序列和基因體上的5mCpG 去甲基化導致。腫瘤細胞中DNA 甲基化既可增多亦可減少，呈現為極不穩定的狀態，導致腫瘤細胞中基因啟動子CGI高甲基化和基因組整體低甲基化可同時存在。

2 DNA甲基化在結直腸癌發生發展中的作用

研究表明，結直腸癌中DNA 異常甲基化頻率更高且早于遺傳學改變，在結直腸癌的發生發展中起重要作用［11］。在結直腸癌中，DNA 高甲基化主要影響基因啟動子區的CGI，而低甲基化主要影響重復性序列。另外，與基因啟動子區高度甲基化相反的是，結直腸癌中基因體呈低甲基化狀態，導致基因印記丟失、有絲分裂后雜合性缺失以及染色體穩定性降低等［10-11］。見圖1。

圖1 結直腸癌中DNA甲基化模式變化及其功能影響

2.1 DNA 低甲基化在結直腸癌發生發展中的作用 人類腫瘤細胞基因組整體甲基化水平降低是最早發現的表觀遺傳學改變。后續研究證實，腫瘤細胞基因組的5mC含量比正常細胞少20%～60%，即腫瘤細胞表現為基因組整體甲基化水平降低。在正常細胞中，基因組的重復序列表現為DNA 高度甲基化，如衛星DNA、長散在重復元件（LINES）、短散在重復元件（SINES）等重復多拷貝序列。哺乳動物基因組中約80%的CpG 位于重復序列且呈散在分布，因此腫瘤細胞基因組整體低甲基化大部分是由于重復序列的5mCpG 去甲基化所致。基因啟動子區域外的DNA 低甲基化可誘導細胞癌變，DNMT 抑制實驗、DNMT 缺陷實驗以及乏甲基膳食喂養實驗均證實DNA 低甲基化可導致基因組不穩定而促進細胞發生惡變。

在結直腸癌中，DNA 低甲基化主要發生在長分散核苷酸元件1（LINE1）。LINE1 占人類基因組的17%，含大量CpG 位點，是研究最廣泛的腫瘤相關去甲基化區域。在正常細胞中，LINE1處于沉默狀態，且甲基化是沉默的主要機制。結直腸癌中LINE1常處于去甲基化狀態，導致其表達升高。LINE1 表達升高使其頻繁穿插于基因組，導致基因組“重編程”及穩定性降低，從而促進腫瘤的發生發展。DNA 去甲基化在結直腸癌中隨著細胞惡變程度遞增而遞增，如結直腸腺瘤、結直腸癌及轉移瘤中均存在基因組整體低甲基化，且去甲基化的程度依次遞增。此外，LINE1 甲基化水平是細胞內5mC 含量的準確指標，可反映基因組整體甲基化水平。與抑癌基因啟動子區高甲基化相對應的是，DNA 低甲基化也可發生于原癌基因啟動子區域。原癌基因啟動子區低甲基化可通過激活原癌基因表達，促進細胞發生癌變。LUO 等［12］研究表明，結直腸癌細胞存在原癌基因MYC 和HRAS 啟動子區低甲基化，經SAM 處理使MYC 和HRAS 基因啟動子區重新甲基化，可顯著減弱結直腸癌細胞的生長增殖能力。盡管結直腸癌中存在原癌基因啟動子DNA 異常低甲基化，但更多的研究證明結直腸癌中特定基因啟動子區主要表現為異常高甲基化，這些異常高甲基化的基因也被稱為假定腫瘤抑制基因。

2.2 DNA 高甲基化在結直腸癌發生發展中的作用 人肺癌和淋巴瘤中降鈣素基因（CALCA）特異性位點高度甲基化是最早報道的高甲基化基因。之后，DNA 高度甲基化成為腫瘤領域的研究熱點。結直腸癌中存在數百個高度甲基化的CGI，這些CGI多位于基因啟動子區域，導致相關基因表達失活。從分子生物學的角度，結直腸癌分為微衛星不穩定性（MSI）、染色體不穩定性（CIN）以及CGI 甲基化表型（CIMP）三個亞類［13］。CIMP 表現為多個抑癌基因啟動子呈高度甲基化狀態。高甲基化誘導沉默的基因幾乎涉及到細胞網絡中的所有信號通路，包括DNA修復、細胞周期以及細胞增殖等。

MSI 約占結直腸癌的15%，是DNA 錯配修復（MMR）蛋白缺失所致。其中，3%的MSI 為遺傳性非息肉病性結直腸癌（Lynch 綜合征），是生殖細胞中 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2 等 MMR 基因突變引起的一種家族性遺傳性疾病；12%為散發性結直腸癌，是體細胞中MLH1 基因啟動子獲得性高甲基化所致［14］。臨床上，Lynch綜合征的診斷策略為MSI分析和MMR蛋白的免疫組化檢測。對于MMR表達缺失的結直腸癌患者，再通過檢測MLH1 基因啟動子是否高度甲基化來區分Lynch 綜合征和散發性結直腸癌。O6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉移酶（MGMT）是一種DNA 損傷修復基因，其編碼蛋白可以抵御細胞突變和烷基化劑的毒性。MGMT基因啟動子區高度甲基化在包括結直腸癌的多種人類腫瘤中被發現，其高甲基化可阻止鳥嘌呤O6位甲基基團的清除，且與 KRAS 和 TP53 基因的 G＞A 突變相關。此外，在結直腸癌患者的前體病變組織及非惡性腸粘膜中也檢測到了MGMT 基因啟動子區高甲基化，推測MGMT表觀遺傳失活是良性鋸齒狀息肉轉化為惡性結直腸癌的重要事件。

細胞周期蛋白依賴的激酶抑制劑2A（CDKN2A）是一種細胞周期調控基因，在G1/S 期轉換中起負調節作用。CDKN2A 位于染色體9p21.3，共有8 個外顯子，通過可變閱讀框編碼P14ARF 和P16INK4α兩種蛋白質，二者都是細胞內重要的抑癌蛋白。在結直腸癌中，CDKN2A 基因通常通過啟動子高度甲基化使之表達缺失。研究表明，CDKN2A基因啟動子區高度甲基化在結直腸腺瘤和異常隱窩病灶中均被檢測到，是結直腸癌發生的早期事件。KIM 等［15］研究表明，11.9%（34/285）的結直腸癌患者存在CDKN2A 基因啟動子區高度甲基化。另外，在微衛星穩定（MSS）和微衛星低不穩定（MSI-L）結直腸癌患者中有10.6%（28/264）表現為CDKN2A高甲基化，而在MSI 患者中有28.6%（6/21）表現CDKN2A 高甲基化，差異有統計學意義［15］。因此，CDKN2A 基因啟動子甲基化的發生與MSI 間可能存在潛在關聯。

腺瘤性結腸息肉病（APC）基因是細胞內最重要的抑癌基因之一，該基因是Wnt信號通路的拮抗劑。Wnt信號通路是細胞正常生理活動中最重要的信號通路之一，其過度活化可誘導MYC、細胞周期蛋白D1 和其他下游基因的表達，促進細胞增殖，驅動細胞癌變［16］。APC表達缺失是結直腸癌發生的早期事件，APC 蛋白的缺乏可促使正常腸上皮轉化為結直腸腺瘤。APC在生殖細胞中突變可導致家族性腺瘤性息肉病（FAP），至少90%的FAP 患者生殖細胞系存在APC 突變。FAP 是一種常染色體顯性疾病，發病個體發展為數百至數千個良性結直腸腺瘤，且通常會轉化為結直腸癌。APC體細胞突變可導致散發性結直腸癌，且多數結直腸癌中都存在APC 基因突變。除了突變失活，20%左右的散發性結直腸癌還存在APC 基因啟動子區高度甲基化。WNT 抑制因子1（WIF1）基因編碼WIF1 蛋白，可直接抑制WNT信號通路。WIF1 蛋白包含一個WNT 抑制因子（WIF）結構域和五個表皮生長因子（EGF）樣結構域，是胚胎發育過程中關鍵的細胞外信號因子。WIF1基因作為抑癌基因，在高達82%的結直腸癌和72%的結直腸腺瘤中表達下調，且所有表達下調的組織樣本均表現為WIF1 基因啟動子區高度甲基化［17］。除此之外，分泌型相關卷曲蛋白基因（SFRPs）、RAS 相關結構與家族基因1A（RASSF1A）等在結直腸癌發生發展中亦發揮重要作用［18-19］。

3 DNA甲基化在結直腸癌中的臨床應用

研究顯示，晚期結直腸癌患者的5 年生存率不足10%，而早期患者5 年生存率90%以上［20］。傳統的糞便隱血試驗（FOBT）和腸鏡檢查篩查結直腸癌存在較大局限性［21］。DNA 異常甲基化在結直腸癌中普遍存在，數百個CGI可同時處于高甲基化狀態，是腫瘤發生過程中最早的變化之一。故研究者們利用DNA 甲基化開發了結直腸癌早期無創篩查標志物，也為抗腫瘤藥物的研發開啟了新的方向。與遺傳學改變相比，表觀遺傳修飾過程可逆，更適用于靶向治療，是極具吸引力的治療位點。

3.1 基因高甲基化作為無創篩查標志物 2014 年美國食品藥品監督管理局（FDA）批準多靶點糞便DNA 篩查結直腸癌，該測試包括KRAS 基因突變、BMP3 和NDRG4 基因甲基化、糞便免疫化學檢測（FIT）。2014 年 IMPERIALE 等［22］發表在《新英格蘭醫學雜志》的一項近萬名受試者參與的隨機試驗研究表明，多靶點糞便DNA 和FIT 篩查結直腸癌的靈敏度分別為92% 和74%，特異度分別為87% 和95%。BOSCH 等［23］研究結果顯示，多靶點糞便DNA和FIT 篩查進展期癌前病變（腸腺瘤和鋸齒狀息肉）的靈敏度分別為46%和27%，特異度分別為89%和93%。因此，多靶點糞便DNA 對結直腸癌的篩查效能顯著優于FIT 檢測，但同時也增加了假陽性風險。鑒于上述兩項前瞻性研究的結果，美國預防服務工作組已將多靶點糞便DNA 納入美國國立綜合癌癥網絡結直腸癌篩查指南，同時建議將其納入美國國家健康保險。2016 年FDA 再次批準Septin9 基因甲基化篩查結直腸癌，這是第一個基于血液樣品檢測的結直腸癌篩查方法。Septin9 編碼一種GTP 結合蛋白，在細胞分裂、細胞周期、細胞凋亡、囊泡運輸、細胞極性和微管系統的調控中起重要作用。Septin9基因啟動子高甲基化導致蛋白表達降低，從而影響上述生理過程。YAN 等［24］使用 Meta 分析對 14 項研究的9 870例患者進行分析，結果顯示血漿Septin9基因甲基化篩查結直腸癌的靈敏度為66%，特異度為91%。此外，有研究表明，多種基因啟動子高甲基化可作為結直腸癌的篩查標志物，如Vimentin、GATA 結合蛋白4（GATA4）以及硫酸類肝素蛋白多糖（SDC2）基因甲基化等［25］。

3.2 基因高甲基化作為治療靶點 DNMT 抑制劑是最常見的表觀遺傳藥物，通過抑制DNMT 的活性發揮抗腫瘤作用。與傳統的化療方案相比，DNMT抑制劑通過重新編碼基因表達過程影響多種細胞，可與其他藥物協同作用，并激活機體免疫反應［26］。根據DNMT抑制劑的結構將其分為核苷類和非核苷類兩大類。核苷類抑制劑在復制過程中代替胞嘧啶摻入DNA，與DNMT共價結合，競爭性抑制DNMT活性，阻斷甲基化反應。常見的核苷類抑制劑有5-氮雜胞苷（阿扎胞苷）、5-氮雜-2-脫氧胞苷（地西他濱）、4-脫氧尿苷（澤布拉林）等。非核苷類藥物通常是針對DNMT結構設計的特異性抑制劑或具有去甲基化功能的傳統藥物，如氨基苯甲酸類、茶多酚類、肼類以及鄰苯二酰胺類等。FDA 已批準阿扎胞苷和地西他濱治療骨髓異常增生綜合征和白血病，但各類實體瘤中均尚未開發出相應的表觀遺傳治療藥物。臨床前研究表明，DNMT 抑制劑用于治療結直腸癌是可行的。DNMT 抑制劑可顯著降低SW48 和HT-29 結腸癌細胞的存活率，以地西他濱與5-氟尿嘧啶或奧沙利鉑協同效果最佳［27］。然而，臨床實驗表明，接受DNMT抑制劑藥物的結直腸癌患者，尚未獲得充足的生存獲益證據［28］。因此，出于安全考慮，現有的DNMT 抑制劑藥物均未進入Ⅱ期臨床試驗。目前，DNMT 抑制劑治療結直腸癌的臨床實驗集中于晚期患者，晚期患者癌細胞異質性顯著并積累大量遺傳學和表觀遺傳學改變。DNA 甲基化通常發生在結直腸癌形成的早期階段，故有研究者推測DNMT 抑制劑在結直腸癌患者的早期階段作為輔助治療藥物可能效果更顯著［17］。

綜上所述，結直腸癌是一種異質性顯著的復雜疾病，具有相似特征的結直腸癌有相同的發病機制和生物學行為。DNA 甲基化是結直腸癌中最常見的表觀遺傳學改變，在結直腸癌的發生發展中發揮重要作用。結直腸癌中存在大量抑癌基因啟動子高甲基化，這些異常沉默的抑癌基因促進了結直腸的發生發展。故研究者們開發了一系列去甲基化藥物，但這些藥物用于治療結直腸癌的臨床試驗均未成功，仍有待研發。此外，DNA 甲基化在結直腸癌中具有普遍性，研發的系列甲基化基因可用于結直腸癌的早期無創診斷。