沉默TSPAN13對前列腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

李蕾蕾，王志強，李常穎，王興芬，孟慶陽，梁銳

1 天津醫科大學第二醫院病理科，天津 300211；2 天津醫科大學第二醫院肛腸外科；3 天津醫科大學第二醫院泌尿外科研究所

前列腺癌（PCa）是男性第二常見癌癥，2020 年全球估計有超過141萬例新發PCa病例和37.5萬例相關死亡病例［1］。近年來，隨著人口老齡化以及飲食結構改變，包括中國在內的亞洲國家PCa 的發病率一直在上升，尤其是老年男性［2-3］。腫瘤發生、發展過程中存在諸多基因異常表達，隨著高通量測序技術和轉錄組學研究的快速發展，更多的異常基因被發現。四跨膜蛋白（TSPANs）是細胞表面蛋白，長度為204～355個氨基酸，包含4個跨膜結構域、細胞內 N 端和 C 端、2 個細胞外結構域和1 個細胞內環［4-5］。TSPANs 在細胞-細胞黏附、細胞外基質-細胞相互作用、細胞生長和凋亡等方面發揮關鍵作用［6-8］。TSPAN13 是 TSPANs 家族的成員之一。研究表明，TSPAN13 在人乳腺癌組織中高表達，抑制TSPAN13 表達可降低ZR-75-30 乳腺癌細胞的生長速度［9］。此外，敲除 TSPAN13 可抑制結腸癌細胞增殖和集落形成［10］。而 TSPAN13 是否參與 PCa 發生、發展仍不清楚。2020 年 5 月—2021 年 5 月，我們探討了TSPAN13 在PCa 中的表達及沉默TSPAN13 后其在PCa細胞系中的生物學功能和潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料 胎牛血清購自天津可典生物科技有限公司，DMEM 培養液、RPMI1640 培養液、胰酶、青鏈霉素雙抗均購自上海源培生物科技有限公司。SYBR Green Fast q-PCR Mix 購自瑞士羅氏公司；反轉錄試劑盒購自美國Thermo 公司；qRT-PCR 引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。PVDF 膜、Transwell 培養小室購自美國 Millipore 公司；ECL 化學發光試劑購自上海雅酶生物醫藥科技有限公司；TRIzol（總RNA抽提試劑）、Western blotting蛋白預染Marker、TSPAN13 抗體、Lipofectamine2000 均購自美國 Invitrogen 公 司 ；GADPH 抗 體 購 自 Proteintech 公司，NC 及si-TSPAN13 由上海吉瑪基因有限公司合成；CCK-8試劑購自西安米鼠生物科技有限公司；基質膠購自美國BD 公司；細胞凋亡試劑盒以及細胞周期試劑盒均購自北京索萊寶生物科技有限公司。人PCa 細胞系（PC3、22Rv1、LNCAP、DU145）和人良性前列腺增生（BPH）細胞系BPH-1均由天津醫科大學第二醫院泌尿外科研究所惠贈。

1.2 方法

1.2.1 PCa 及 BPH 組織中 TSPAN13 蛋白表達檢測 征得天津醫科大學第二醫院倫理委員會同意后，在病理科收集2019 年PCa 組織和BPH 組織的病理蠟塊各20例份，將蠟塊重新切片后進行免疫組化檢測。病理組織納入標準：①PCa：患者術前行前列腺穿刺活檢術，確診PCa，同時術前、術后均未行任何抗腫瘤治療，并且患者自身無其他腫瘤病史。②BPH：患者首先行經尿道前列腺電切術，術后確診為BPH，但不包括同時伴有前列腺上皮內瘤變。實驗采用SP 免疫組化二步法檢測PCa 及BPH 組織中TSPAN13 蛋白表達。60 ℃烤片1 h，復溫至室溫后二甲苯脫蠟30 min，PBS 洗3 次后在高溫下使用EDTA 進行抗原修復，PBS 洗3 次，然后在濕盒內進行孵育，滴加阻斷內源性過氧化物酶室溫孵育10 min，PBS 沖洗 3 次，TSPAN13 抗體均按照說明書比例稀釋，滴加一抗后4 ℃冰箱過夜，PBS沖洗3次，滴加二抗室溫孵育 1 h，PBS 沖洗 3 次，滴加 DAB 顯色液，室溫孵育5 min，最后蘇木素復染，脫水，透明，封片。

1.2.2 細胞培養 PC3 細胞、22Rv1 細胞、LNCAP細胞、DU145 細胞用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗的RPMI1640 培養基培養，BPH-1 細胞用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗的DMEM 培養基培養，培養環境均為37 ℃、5%CO2、飽和濕度。

1.2.3 TSPAN13 mRNA 在 PCa 細 胞 系 及 BPH-1 細胞中的表達檢測 采用RT-PCR 法。首先對貼壁的細胞提取總RNA，再使用反轉錄試劑盒將配好的試劑置于金屬浴中，設定參數（25 ℃5 min→42 ℃60 min→70 ℃ 5 min），進行反轉錄合成 cDNA。GAPDH 正向引物：5'-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3'，反向引物：5'-GCCATCACGCCACAGTTTC-3'；TSPAN13正向引物：5'-TATCTTGCGCTTGTTTAGCCC-3'，反向引物：5'-ACTTGCCGTATTGTTCCAACC-3'。之后將引物以及其余反應物按說明書配置成一定比例的反應體系用無酶槍頭加入96孔板，再放入提前預熱好的qPCR 儀中，設定參數95 ℃ 10 min→（95 ℃ 15 s→60 ℃ 20 s→72 ℃ 30 s）×40，觀察 qPCR 的熔解曲線和擴增曲線，計算實驗數據，最后用GraphPad Prism軟件進行柱狀圖量化分析結果。

1.2.4 TSPAN13 蛋 白 在 PCa 細 胞 系 及 BPH-1 細 胞中的表達檢測 采用Western blotting 法。首先使用蛋白提取試劑對貼壁細胞進行總蛋白提取，通過Bradford 法測定蛋白質濃度，蛋白樣品與5×SDS 上樣緩沖液以4∶1 的體積混合，100 ℃煮沸5 min（或95 ℃煮沸10 min）；按照蛋白定量結果進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將蛋白轉到PVDF 膜上，用5%的脫脂牛奶進行封閉，封閉完成后進行一抗二抗的孵育，最終采用ECL 化學發光法對蛋白條帶進行成像處理，最后用Image J軟件進行量化分析結果。

1.2.5 細胞分組及轉染 本實驗采用雙細胞系驗證，因此在PC3 和DU145 細胞中的分組情況一樣。細胞分組：陰性對照組（NC組）、小干擾轉染組1（si1-RNA組）、小干擾轉染組2（組si2-RNA），將1.0×105個PC3細胞和1.5×105個DU145細胞接種于6孔板中培養過夜，轉染前將培養基更換為Opti-MEM培養基，使用Lipofectamine2000將針對TSPAN13的特異性si-RNA（si1-TSPAN13：5'-AGACUAACCAAGGUGUAAAGC-3'，si2-TSPAN13：5'-AUUAGCAGCAGACUAACCA-3'）轉染至細胞，12 h 后進行加液處理。再將6 孔板放入細胞培養箱中進行正常培養即可。待48 h或72 h 細胞長滿后，對轉染si-RNA 后的細胞進行RNA和蛋白的提取及相關的生物學行為驗證實驗。

1.2.6 si-RNA 轉染后細胞中TSPAN13 表達檢測 參照 1.2.3 和 1.2.4，采用 RT-PCR 和 Westernblotting法檢測各組細胞TSPAN13 表達。選擇合適的si-RNA進行后續的生物學行為驗證。

1.2.7 細胞增殖能力檢測 采用CCK-8 法。首先使用針對TSPAN13 特異性si2-RNA 對PC3 細胞和DU145 細胞進行沉默處理，取處于對數生長期的各組細胞，用不含血清的RPMI1640 培養基制備成2×104/mL 的細胞懸液，取100 μL 細胞懸液接種到96孔板中，每組細胞5 個復孔，將 10 μL 的CCK-8 溶液按照0、24、48、72 h 時間點分別添加到培養基中，并在37 ℃下孵育4 h。采用酶標儀測量每個孔在波長450 nm 處的吸光度（OD 值）。最終對各組的吸光度進行統計分析。

1.2.8 細胞克隆生成能力檢測 采用細胞集落形成實驗。首先使用針對TSPAN13特異性si2-RNA對PC3 細胞和DU145 細胞進行沉默處理，取處于對數生長期的各組細胞，用含10%血清的RPMI1640培養液制備成1×103/mL的細胞懸液，取2 mL細胞懸液接種到6孔板中，以十字方向輕輕晃動使細胞分散均勻。將培養皿置37 ℃、5%CO2培養箱中培養5～7 d，當培養皿中出現肉眼可見克隆時，終止培養，4%的多聚甲醛固定，0.1%的結晶紫染液染色，拍照記錄實驗結果。最終對克隆形成的細胞集落數進行計數統計分析。

1.2.9 細胞遷移能力檢測 采用細胞劃痕實驗。首先使用針對TSPAN13特異性si2-RNA 對PC3細胞和DU145 細胞進行沉默處理，提前用標記筆在6 孔板背面均勻劃橫線，每隔0.5～1 cm 一橫線以方便定位。取對數生長期的各組細胞，用含10%血清的RPMI1640 培養液制備成 1×105/mL 的細胞懸液，取2 mL 細胞懸液接種到6 孔板中，待其融合度達90%以上時用200 μL 的無菌槍頭參照垂直于孔板背后的橫線進行劃痕（注意槍頭要垂直劃痕，且劃痕時里面必須有液體），每個孔劃3道。盡量去除脫落的細胞，然后加入2 mL不含血清的RPMI1640培養基，置于37 ℃培養箱中繼續培養，分別于劃痕后的0、24 h進行取點拍照并保存（必須是同一位置）最終對其遷移距離進行分析。

1.2.10 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell 實驗。首先使用針對TSPAN13特異性si2-RNA 對PC3細胞和DU145 細胞進行沉默處理，取處于對數生長期的各組細胞，用不含血清的RPMI1640 培養液制成密度為1×105/mL 的細胞懸液。采用孔徑為8.0 mm 的Transwell 小室，在小室加入50μL 的基質膠后，待其凝固后再加入 200 μL 的細胞懸液，將 750 μL 含20%血清的RPMI1640 培養基分別加入下腔室72 h/120 h 后，對通過膜的細胞用0.1%結晶紫染色，并在熒光顯微鏡下計數細胞數：隨機選取5個視野進行計數并做統計分析。

1.3 統計學方法 采用SPSS25.0 統計軟件。計量數據符合正態分布以表示，組間比較采用t檢驗及方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 生物信息學分析TSPAN13 mRNA 在PCa 中表達 GEO 數據庫及TCGA 數據庫預測結果證實，TSPAN13 mRNA在PCa樣本中表達高于正常前列腺樣本（P＜0.01），見圖1。

圖1 TSPAN13 mRNA在PCa樣本和正常前列腺樣本中的表達

2.2 IHC 驗證生物信息學的分析結果 對分別選取的 20例 PCa 和 BPH 組織切片進行 IHC 染色，結果顯示，TSPAN13 在PCa 中的陽性表達率為65%（13/20），在BPH 中的陽性表達率為10%（2/20），相較于BPH，TSPAN13在PCa組織中的陽性表達率增加（P＜0.01）。

2.3 人PCa 細胞系（PC3、22Rv1、LNCAP、DU145）、BPH-1 細胞中TSPAN13 mRNA 和蛋白表達 人PCa細胞系 PC3、22Rv1、LNCAP、DU145、BPH-1 細胞中TSPAN13 mRNA 相對表達量分別為6.524±0.077、2.168 ± 0.017、6.635 ± 0.136、4.037 ± 0.057、1.001 ± 0.460，TSPAN13 蛋白相對表達量分別為5.161 ± 0.218、2.437 ± 0.091、3.059 ± 0.289、3.006 ± 0.211、1.000 ± 0.101，TSPAN13 mRNA 在人PCa 細胞系（PC3、22Rv1、LNCAP、DU145）中的表達高于BPH-1 細胞（P均＜0.01）；TSPAN13 蛋白在人PCa 細胞系（PC3、22Rv1、LNCAP、DU145）中的表達高于BPH-1細胞（P均＜0.01）。

2.4 轉 染 si-RNA 后 PC3 和 DU145 細 胞 中TSPAN13 mRNA 和蛋白表達 轉染si-RNA 72 h 后，PC3 細 胞 中 NC 組 、si1-TSPAN13、si2-TSPAN13 組TSPAN13 mRNA 相對表達量分別為1.002±0.083、0.275 ± 0.053、0.068 ± 0.049，蛋白相對表達量分別為1.000±0.017、0.375±0.056、0.349±0.037，PC3 細胞中 si1-TSPAN13、si2-TSPAN13 組 TSPAN13 mRNA 和蛋白的表達均低于 NC 組（P均＜0.01）；DU145 細胞中 NC 組、si1-TSPAN13、si2-TSPAN13 組TSPAN13 mRNA 相對表達量分別為1.000±0.031、0.282 ± 0.028、0.196 ± 0.033，蛋白相對表達量分別為1.000±0.039、0.313±0.008、0.063±0.057，在 DU145 細 胞 中 si1-TSPAN13、si2-TSPAN13 組TSPAN13 mRNA 和蛋白表達均低于 NC 組（P均＜0.01），且si2-TSPAN13 的沉默效果更明顯，差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.5 沉默 TSPAN13 后 PC3 和 DU145 細胞的增殖能力和克隆形成能力 轉染si-RNA 72 h 后，PC3 細胞中 NC 組、si2-TSPAN13 組細胞 OD 值分別為 2.062 ±0.085、1.598 ± 0.016，DU145 細胞中 NC 組、si2-TSPAN13 組 細 胞 OD 值 分 別 為 1.918 ± 0.052、1.071 ± 0.053，在 PC3 細胞中 si2-TSPAN13 組 OD 值低于NC 組（t=15.87，P＜0.01）；在DU145 細胞中si2-TSPAN13 組 OD 值低于 NC 組（t=21.74，P＜0.01）。對轉染si-RNA 的細胞進行劃痕操作24 h 后，PC3 細胞中NC 組、si2-TSPAN13 組細胞克隆數分別為（906.667 ± 24.379）、（334.667 ± 9.074）個，DU145細胞中NC 組、si2-TSPAN13 組細胞克隆數分別為（1 059.000 ± 58.924）、（747.667 ± 31.817）個，在PC3、DU145 細胞中 si2-TSPAN13 組細胞克隆數低于NC組（P均＜0.01）。

2.6 沉默 TSPAN13 后 PC3 和 DU145 細胞的遷移和侵襲能力 轉染si-RNA 72 h 后，PC3 細胞中NC 組、si2-TSPAN13 組細胞遷移率分別為（65.997 ±2.899）%、（45.723 ± 2.531）%，DU145 細胞中 NC組、si2-TSPAN13 組細胞遷移率分別為（63.829 ±4.365）%、（27.432 ± 3.508）%，在 PC3 和 DU145 細胞中si2-TSPAN13組細胞遷移率均低于NC組（P均＜0.01）。轉染 si-RNA72 h 后，PC3 細胞中 NC 組、si2-TSPAN13 組細胞穿膜數分別為（106.400± 9.343）、（4.200 ± 2.490）個 ，DU145 細 胞 中 NC 組 、si2-TSPAN13 組細胞穿膜數分別為（273.800± 9.628）、（52.800 ± 6.535）個，在 PC3 和 DU145 細胞中 si2-TSPAN13組細胞穿膜數均低于NC組（P均＜0.01）。

3 討論

PCa 是男性最常見的癌癥之一，其最初發病較為隱蔽，通常隨時間的推移會發展為去勢抵抗性PCa，在現有診斷和治療條件下，PCa 患者的生存和預后仍不理想，患者最終會因產生耐藥而無法治愈，導致死亡。因此找到PCa相關的異常基因并了解其致病機制，對PCa 的早期診斷和尋找治療靶點極為重要。從BPH到PCa中最常見的異常基因是雄激素受體（AR）和磷脂酶和張力蛋白同源物（PTEN）。PCa 主要是由AR 信號驅動的細胞生長介導的激素驅動疾病。在PCa 中，雄激素信號傳導上調。其在循環雄激素的影響下調節AR 作用，增強與AR 調節的各種基因轉錄和表達相關的AR 活性，從而影響PCa的發生、發展［11］。

PTEN 是一種腫瘤抑制因子，在PCa 樣本中表達下調。PTEN 的下調導致PI3K/Akt 通路的激活從而影響 PCa 的發生、發展［12］。此外 PTEN 的下調還與較高的Gleason 評分、進展風險和治療后復發以及晚期局部或轉移性疾病和死亡相關［13］。此外，TMPRSS2、MYC、SMAD4、EZH2 等基因異常表達構成了基因組多樣性啟動PCa并推動其進展［14］。

四膜蛋白家族中的部分蛋白，如CD82、CD151和CD81 參與了有機體諸多生理過程，因而受到越來越多關注［15-17］。在體外研究中，TSPAN1 的下調抑制了結腸癌細胞的增殖和侵襲［18］，在p53 突變的肺癌細胞中過表達TSPAN2 與癌癥的侵襲和轉移有關［19］，在大鼠胰腺癌、肺癌等模型中，TSPAN8 有助于外泌體誘導的內皮細胞活化［20］。作為四膜蛋白家族的成員，TSPAN13 參與了腫瘤的發生發展。有研究報道，TSPAN13 在乳腺癌中的表達與細胞的增殖和遷移相關［21］。但 TSPAN13 在 PCa 中的表達及其相關功能卻鮮見報道。

IHC 實驗驗證結果顯示，TSPAN13 蛋白在PCa中陽性率高于BPH，ARENCIBIA 等［22］研究結果與本研究的結果一致。其次，在PCa 細胞和BPH-1 細胞中通過RT-PCR 和Western blotting 實驗驗證結果顯示，與 BPH-1 細胞相比，TSPAN13 mRNA 和蛋白在PCa細胞中高表達。

TSPAN13 在PCa 中高表達，實驗針對TSPAN13的堿基編碼序列設計了si-RNA，通過RT-PCR 和Western blotting 兩種方法檢測序列的特異性，其結果顯示，沉默 TSPAN13 后，TSPAN13 mRNA 和蛋白表達均降低，且si2-TSPAN13 的沉默效果優于si1-TSPAN13。因此后續采用si2-TSPAN13 來進行功能試驗。

本研究結果表明，沉默TSPAN13 可抑制PC3 細胞和DU145 細胞的增殖和克隆形成能力。沉默TSPAN13 后PC3 細胞和DU145 細胞的遷移和侵襲能力明顯下降。

綜上所述，沉默TSPAN13 表達可抑制前列腺癌細胞PC3 和DU145 細胞的增殖、克隆生成、遷移、侵襲能力，TSPAN13可能在PCa細胞增殖、遷移和侵襲過程中發揮重要作用。