血清PCSK9水平與PCI后冠狀動脈病變再進展的關系研究

王蘭 葉玉蘭 寧明安 張迪 尚粉青

(1.西安市第一醫院心內科，陜西 西安 710002； 2.西安市高新醫院心內科，陜西 西安 710075； 3.西安市胸科醫院轉化醫學中心，陜西 西安 710100)

近年來，中國經皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)開展數量迅猛上升，技術亦得到長足進步，極大地降低了冠心病患者的死亡率。然而臨床中發現PCI后有不少嚴格控制危險因素并堅持服藥的患者仍發生冠狀動脈病變再進展，需再次行PCI，增加了患者的痛苦和經濟負擔。目前對于冠狀動脈支架植入術后再狹窄的危險因素研究很多，觀察期多在術后1～2年，而對于術后3～5年病變再進展的相關危險因素研究較少，有學者認為新發動脈粥樣硬化仍是其本質，而慢性炎癥反應是核心因素。前蛋白轉化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9)作為新的炎癥相關因子備受關注，它是前蛋白轉化酶家族的第9個成員，其通過促進肝臟低密度脂蛋白受體溶酶體的降解，降低血漿中低密度脂蛋白的清除率，參與動脈粥樣硬化的形成，然而PCSK9與PCI后冠狀動脈病變再進展是否相關成為關注的焦點。本研究旨在探討血清PCSK9與PCI后冠狀動脈病變再進展的相關性，另設計體外試驗對其機制進行初步研究，為PCI后冠狀動脈病變再進展的預防與治療提供新思路和新方法。

1 臨床研究對象與方法

1.1 研究對象

收集2016年1月—2021年1月西安市第一醫院和西安市高新醫院收治的冠心病并行PCI以及于術后3～5年因心絞痛行冠狀動脈造影的患者為研究對象。根據造影結果將患者分為對照組(36例)和觀察組(38例)。納入標準：(1)冠狀動脈造影提示至少一根血管狹窄≥70%并首次成功接受PCI；(2)于術后3～5年因再發心絞痛復查冠狀動脈造影者；(3)患者自愿加入本研究。排除標準：(1)既往曾接受過PCI或冠狀動脈旁路移植術患者；(2)合并結構性心臟病或冠狀動脈慢性閉塞病變患者；(3)合并惡性腫瘤、自身免疫性疾病、血液系統疾病伴出血傾向或凝血障礙、消化性潰瘍及新發腦血管意外患者；(4)患者拒絕加入本研究。

1.2 PCI方案

PCI過程：患者服用拜阿司匹林腸溶片(術前300 mg，術后每次100 mg，每天1次)，同時服用氯吡格雷片(術前300～600 mg，術后每次75 mg，每天1次)或替格瑞洛片(術前180 mg，術后每次90 mg，每天2次)，接受肝素鈉注射液(術前3 000 U動脈穿刺時給藥，術中每小時100 U/kg)治療，術后上述抗血小板藥及他汀類藥物(阿托伐他汀鈣片，每次20 mg，每晚1次或瑞舒伐他汀鈣片，每次10 mg，每晚1次)至少持續服用1年。手術操作由導管室冠狀動脈介入醫師完成，造影結果由兩名以上冠狀動脈介入醫師閱讀并分析狹窄程度。

1.3 PCI后冠狀動脈病變再進展的判斷標準

(1)與支架相關的冠狀動脈病變進展：支架近端和遠端5 mm內及支架內再次狹窄程度≥50%。(2)與支架無關的冠狀動脈病變進展：同一支血管支架近端和遠端5 mm外血管內徑狹窄程度≥50%，或不同支血管內徑狹窄程度≥50%。

1.4 分組標準及資料收集

冠狀動脈造影符合上述冠狀動脈病變再進展判斷標準的為觀察組，進展程度小于上述判斷標準以及完全正常的為對照組。收集患者以下資料：(1)一般資料：包括年齡、性別、飲酒及吸煙史等。(2)既往病史：包括糖尿病、高血壓及心肌梗死。(3)實驗室指標：包括血常規及生化指標。

1.5 血液標本的采集與處理

研究對象于復查冠狀動脈造影術后第2天采集空腹靜脈血5～10 mL(肝素抗凝)，1 000 r/min離心15 min，-70 ℃保存備用。采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗測定血清PCSK9水平及炎癥因子白介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-ɑ(tumor necrosis factor-ɑ，TNF-ɑ)及單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)水平，試劑盒由R&D公司提供。其他生化指標檢測送往西安市第一醫院檢驗科進行檢測。

2 細胞培養及實驗方法

2.1 材料

人主動脈平滑肌細胞(smooth muscle cell，SMC)購自Sciencell公司，PCSK9試劑購自Novoprotein公司，PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗體、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)抗體及β-肌動蛋白抗體購自Santa Cruz公司；凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體-1(lectin-like oxidized low-density lipoprotein recepter-1，LOX-1)抗體購自Abcam公司。蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑(德國Roche公司)，ECL發光液(Vazyme公司)，Trizol試劑(Invitrogen公司)，HiScriptTMqPCR SuperMix逆轉錄試劑盒(Vazyme公司)，PCR DNA聚合酶(Vazyme公司)，其余試劑為國產分析純。實時定量PCR儀及梯度PCR儀(美國Applied Biosystems公司)，WB電泳儀和電泳槽、WB半干轉膜槽(BIO-RAD公司)，自動洗片機(柯達公司)。

2.2 細胞培養

將在干冰保存中的SMC懸液常規解凍及復蘇，以1×105細胞密度培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于細胞培養箱中，以37 ℃、5% CO2條件下培養，倒置顯微鏡下觀察，當SMC達到90%融合時，胰蛋白酶消化進行傳代。采用對數生長期細胞進行實驗。

2.3 免疫印跡分析

SMC經磷酸鹽緩沖液洗兩遍，加入蛋白裂解液，冰上裂解20 min；液氮凍融3次，4 ℃，12 000 r/min離心15 min，取上清，ABC法測定蛋白濃度。加入上樣緩沖液，95 ℃，8 min蛋白變性。10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳(上層膠30 mA，30 min；下層膠50 mA，90 min)，轉膜(230 mA，2 h)，5%的脫脂牛奶(TTBS配制)封閉1 h，孵一抗4 ℃過夜，TTBS洗3遍，每遍5 min；孵二抗，室溫1 h；ECL發光，自動洗片機洗片。標定標記，進行掃描和分析。

2.4 實時熒光定量PCR

六孔板每孔內皮細胞加入Trizol試劑1 mL，提取RNA，RNA濃度采用紫外分光光度計檢測。取2 μg總RNA進行逆轉錄(參照HiScriptTMqPCR SuperMix逆轉錄試劑盒說明書)。逆轉錄得到的cDNA進行實時定量PCR反應，反應體系參照TaqMan universal PCR Master Mix說明書。

3 統計學方法

4 結果

4.1 對照組與觀察組臨床資料的比較

對照組和觀察組臨床特征比較見表1。兩組患者性別、吸煙以及高血壓、高脂血癥和2型糖尿病病史人數所占比例經χ2檢驗結果顯示，兩組患者性別、高血壓及高脂血癥病史人數所占比例差異均無統計學意義(P>0.05)，觀察組患者吸煙和2型糖尿病病史人數所占比例均明顯高于對照組(P<0.05)。兩組患者年齡、白細胞、紅細胞、血紅蛋白、血小板、谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶、尿素氮、肌酐、胱抑素C、總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、空腹血糖及糖化血紅蛋白經獨立樣本t檢驗結果顯示，兩組患者年齡以及白細胞、血小板、谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶、尿素氮、肌酐、胱抑素C、總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、空腹血糖和糖化血紅蛋白水平差異均無統計學意義(P>0.05)，觀察組紅細胞及血紅蛋白計數均明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 一般資料比較

4.2 對照組與觀察組PCSK9及炎癥因子水平比較

兩組患者PCSK9及炎癥因子水平比較見表2及圖1。兩組患者PCSK9及炎癥因子水平經獨立樣本t檢驗結果顯示，觀察組PCSK9及炎癥因子水平均明顯高于對照組，差異有統計學意義(均P<0.05)。

表2 兩組間PCSK9及炎癥因子水平比較

注：***表示與對照組相比，P<0.001。

4.3 血清PCSK9與炎癥因子IL-6、TNF-ɑ及MCP-1的相關性分析

血清PCSK9與炎癥因子的相關性分析見圖2。對所有研究對象進行Pearson相關性分析結果顯示，PCSK9與炎癥因子IL-6、TNF-ɑ及MCP-1呈明顯正相關(r=0.448 1、0.465 1、0.512 5，均P<0.01)。

圖2 血清PCSK9與炎癥因子的相關性分析

4.4 PCSK9對SMC表型變化的影響

分別用不同濃度的PCSK9(0 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL和2 μg/mL)刺激內皮細胞24 h，實時熒光定量PCR結果顯示PCSK9可顯著降低SMC中α-SMA的mRNA表達且呈濃度依賴性(見圖3A)。以1μg/mL的PCSK9作用于內皮細胞24 h，可見收縮型因子α-SMA、平滑肌特異性蛋白(smoothelin，SMTH)及調寧蛋白(calponin)mRNA表達明顯減少，而分泌型因子纖維連接蛋白(fibronectin，FN)、OPN、血小板反應蛋白(thrombospondin，THBS)mRNA表達顯著增加(見圖3B)。免疫印跡結果顯示PCSK9作用于SMC，其α-SMA表達顯著減少，OPN表達顯著增加(見圖3C和3D)。

4.5 PCSK9對SMC細胞LOX-1表達的影響

PCSK9作用于SMC，實時熒光定量PCR及免疫印跡結果顯示LOX-1表達顯著增加(見圖4)。

注：*表示與對照組相比，P<0.05；**表示與對照組相比，P<0.01；***表示與對照組相比，P<0.001；GAPDH，3-磷酸甘油酫脫氫酶。

注：*表示與對照組相比，P<0.05；**表示與對照組相比，P<0.01；GAPDH，3-磷酸甘油酫脫氫酶。

5 討論

冠狀動脈支架植入術后病變再進展是影響冠心病患者預后的重要因素，主要包括支架內再狹窄和支架外其他血管狹窄，通常認為支架內再狹窄是由于內皮損傷和支架機械刺激后啟動局部炎癥反應，在多種細胞因子的參與下，血管SMC發生異常遷移和增殖，血管內膜增生，管腔直徑變小，導致支架內再狹窄[1]，這種過程類似于新發動脈粥樣硬化斑塊的形成，往往發生在支架植入術后1～2年，對于支架植入術后3年以上的患者發生病變進展的機制研究報道較少，其部分與支架內再狹窄形成機制相似，但又不完全一致。受炎癥因子與支架內再狹窄呈正相關的報道[2-3]啟示，筆者收集支架植入術后病變再進展患者血清并檢測炎癥因子，而PCSK9作為動脈粥樣硬化斑塊形成中的促炎因子，其獨立于血脂代謝參與炎癥反應的重要作用也引起了筆者的關注。

本研究發現觀察組血清炎癥因子及PCSK9水平明顯高于對照組，且二者有相關性，提示慢性炎癥學說可能也是支架植入術后病變再進展的核心因素。有研究報道PCSK9和炎癥因子與冠心病患者的相關性[4-6]，說明各種炎癥介質和細胞貫穿粥樣硬化的始終并形成惡性循環，其部分通過氧化型低密度脂蛋白誘導巨噬細胞中炎癥因子的分泌來增強PCSK9的表達[7-8]。Giunzioni等[9]又指出脂多糖刺激巨噬細胞中PCSK9的表達可增加炎癥因子的轉錄水平，因此可看出PCSK9與炎癥因子的相關作用加重炎癥反應和動脈粥樣硬化的形成[10]，這可能也是筆者團隊研究中病變再進展患者PCSK9及炎癥因子高于未進展患者的原因。

除炎癥學說外，SMC表型轉化在動脈粥樣硬化和支架內再狹窄的形成中發揮重要作用，主要促進了血管內膜增生和血管重塑[11-13]。為進一步探討PCSK9與支架植入術后病變再進展的機制，筆者進一步設計了細胞實驗，主要針對SMC表型轉化。研究發現PCSK9作用于SMC后表型由收縮型轉化為分泌型，同時LOX-1的表達增加，而LOX-1作為氧化型低密度脂蛋白的特異性受體參與動脈粥樣硬化的形成及斑塊的穩定性，因此筆者推測PCSK9使SMC的表型轉化是由LOX-1介導完成，后使血管發生病理性重塑導致病變再進展，其中具體機制后期筆者可通過進一步體外實驗探討。

基于PCSK9與炎癥的相關性并參與動脈粥樣硬化的形成，目前臨床上對于多支血管病變、慢性閉塞病變以及冠心病規范藥物治療情況下仍發生狹窄的患者嘗試應用PCSK9抑制劑，除了明顯降低血脂水平、延緩血管炎癥以及動脈粥樣硬化的進展外，對炎癥因子水平的降低和其他心血管保護作用也引起關注[14]。筆者的研究為冠狀動脈支架植入術后患者使用PCSK9抑制劑而延緩病變再進展提供了理論依據。

本研究尚有一定的局限性，由于樣本量偏少，未對冠狀動脈病變進展程度進行量化分組，而其是否與PCSK9水平有量化關系，后期可進一步擴大樣本量來研究證實。另外本研究是橫斷面研究，不能確定PCSK9與PCI后冠狀動脈病變再進展的因果關系，很可能是相關炎癥因子或存在未知的第三因素同時影響二者的變化。最后PCSK9抑制劑是否真正能延緩PCI后冠狀動脈病變再進展，需下一步的前瞻性臨床研究證實，為該類患者的預防及治療找到新的途徑。