表觀遺傳年齡與衰老和心血管疾病的研究進展

傅義程 張福春 劉慧琳

(北京大學第三醫院老年內科，北京 100191)

衰老是一個不可避免的生物學過程。衰老伴隨有器官功能下降和環境易感性增加，衰老已成為心血管疾病等年齡相關疾病的主要風險因素，因此衰老及抗衰老機制研究一直是老年醫學領域的研究熱點。近年來隨著分子生物學技術的快速進展，已有諸多研究證明，表觀遺傳學調控在衰老及心血管疾病的發生和發展中發揮著重要作用[1]。由DNA甲基化數據構建的DNA甲基化年齡(DNAm年齡)，也稱為表觀遺傳時鐘，可精確地評估人體生物年齡并用于衰老疾病的研究[2]?，F對表觀遺傳年齡的發展、與衰老和心血管疾病的關聯、相關機制及應用前景做出詳細闡述。

1 表觀遺傳年齡的發現歷史

目前普遍認為，以時間來定義的人類年齡，不能很好地反映人體和組織器官的衰老狀態，生物年齡的概念因此提出。近年來，生物年齡評估工具的研發取得了飛速進展，而DNA甲基化水平則被認為是最有希望的研究方向[3]。人體細胞內胞苷磷酸鳥苷(cytidylyl phosphate guanosine，CpG)的甲基化狀態會隨年齡增長而變化，發生位點特異性高甲基化或局部低甲基化[4]，這些CpG集合也稱為CpG時鐘。利用甲基化陣列技術識別CpG，通過特定數學算法，可獲得以年為單位的生物DNA樣本的生物年齡，稱為DNAm年齡[5]。DNAm年齡具有組織同步性，雖然各組織甲基化程度有組織特異性，但得出的DNAm年齡卻基本類似，因而能預測與年齡相關的整體變化，被認為可客觀地反映個體的衰老程度[6]。DNAm年齡是通過微陣列芯片對來自不同或已知年齡個體的組織樣本中的數千個CpG位點進行分析來得出的。對于一個給定的組織樣本，通過微陣列芯片分析基因組的多個拷貝數，將每個CpG位點賦予一個0～1的β值，這與該位點被甲基化的基因組拷貝在樣本中的比例相對應。例如，一個特定的CpG位點β值為0.40，表明有40%的基因組拷貝在該特定位點有甲基化的CpG[3]。一旦確定了CpG位點的甲基化狀態，用監督機器模型的懲罰回歸算法如LASSO、ridge回歸或彈性凈回歸等方法，將β值映射到實際年齡值。這種機器學習算法首先在數據子集(訓練集)中學習，然后在其余的數據集(測試集)中評估結果模型的預測性能和準確性。生理年齡相似的不同個體利用算法評估后可得到在表觀遺傳時鐘中回歸線周圍的年齡偏差，這些偏差的絕對值代表了不同個體的生物年齡，可視為評價個體衰老程度的生物標志物[7]。

表觀遺傳年齡工具的發現歷經更迭。第一代工具選擇了人唾液樣本DNA構建[8]。第二代工具代表性的是Hannum時鐘，是選擇血液DNA樣本中的71個CpG分析構建的[9]。但Hannum時鐘僅適用于血液樣本，因此應用受限[10]。2010年，有研究[5]發現在人體細胞某些特定基因區域內存在一部分高度保守的DNA高甲基化位點，如二價染色體結構域和核糖體起始復合體2。從而克服了機體不同組織細胞中的DNA甲基化程度各異的難題，因此能通過這些高度保守的甲基化位點來開發第三代工具，即Horvath時鐘。Horvath時鐘是從來自成人和兒童的30多種不同組織和近8 000例DNA微陣列樣本，從中選取核糖體起始復合體2靶基因的69個與年齡相關的高甲基化CpG來構建的，是迄今準確性最高的表觀遺傳年齡工具，可準確地衡量人體生命周期各階段、各器官組織以及細胞來源樣本的生物年齡[11]。它能與微陣列、焦磷酸測序、定量聚合酶鏈反應和二代測序等各種甲基化檢測平臺兼容，穩定性較好，精度較高，較少受缺失數據的影響，因而得到廣泛應用[12]。此后，Levine等[13]將患者臨床變量和DNAm年齡結合，構建了基于臨床表型的表觀遺傳年齡工具，將環境因素與衰老生物年齡信息嘗試建立聯系，旨在預測衰老與疾病之間的聯系。之后在群體研究中，發現一些個體顯示出DNAm年齡高于或低于實際年齡的現象，被稱為表觀遺傳年齡加速，分為負向加速和正向加速。負向加速代表實際衰老速度減慢[14]，而正向加速代表實際衰老速度加快，全因死亡風險增高[15]。當細胞基因組產生不穩定時，表觀遺傳年齡加速增快，進一步激活表觀遺傳調控來限制體細胞突變，增強了細胞分化的穩定性，延緩了細胞衰老，降低了疾病的發生風險。

2 表觀遺傳年齡與衰老

DNAm年齡可反映機體組織細胞隨年齡增長的細微功能變化，隨著年齡增加，這些變化逐漸積累，最終導致組織器官功能下降和機體衰老。衰老的表觀遺傳時鐘理論認為，DNAm年齡可以看作一種代表生物衰老的分子印跡，諸多研究證實DNAm年齡在預測自然壽命、疾病預后及全因死亡方面有著重要作用[16]。利用表觀遺傳年齡工具測量的機體衰老稱為表觀遺傳衰老，分為內源性和外源性。細胞內源性衰老可使用Horvath時鐘檢測[13]，與表型相關的外源性衰老，可使用Hannum時鐘或使用DNAm年齡與臨床表型結合的方式來測量，更適用于評價衰老相關的組織器官病理功能減退。表觀遺傳全基因組研究[14]表明，加速的外源性表觀遺傳衰老可使得老年人衰弱程度加重。CpG功能研究有助于闡明表觀遺傳衰老的具體作用機制。Horvath時鐘的CpG分析發現，與年齡相關的CpG位點位于細胞調控分化相關基因的啟動子或增強子內，DNA甲基化可調控連接基因組拓撲結構的染色質架構蛋白CTCF與DNA的結合，進而通過與增強子和啟動子的長期相互作用來調控基因表達[17-18]。一項研究[19]使用 Illumina 450K微陣列芯片分析老年雙胞胎常染色體CpG的甲基化數據，鑒定出了1 316個與年齡相關的CpG，其中年齡相關性最強的CpG位于衰老調控基因ELOVL2的啟動子中。此外，有一些研究結果表明，表觀遺傳時鐘所使用的CpG位點富集于Polycomb蛋白復合體的靶基因位點，Polycomb蛋白復合體主要通過甲基化修飾發揮對控制細胞發育分化的靶基因的沉默作用而參與了細胞衰老的調控[20]，以上發現為進一步深入理解細胞衰老提供了表觀遺傳學的研究證據。

表觀遺傳調控抗衰老應用最著名的研究為山中因子(Yamanaka factors)Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc，是采用基因編輯技術，將已分化的細胞基因組的DNA甲基化圖譜全部清除，然后導入山中因子進行短暫細胞重編程，使細胞基因組重新進行甲基化標記而得到與胚胎干細胞相似的甲基化圖譜，從而重置表觀遺傳年齡而減緩衰老[21]。2016年在早衰小鼠中進行的測試表明，短暫促進山中因子表達可使小鼠壽命延長約30%[22]。2020年發表在Nature雜志的文章中，有研究[23]發現用山中因子Oct4、Sox2和Klf4治療衰老鼠，可使自然老化鼠的視力下降得到一定恢復。2022年發表在Nature雜志的文章中，有研究者[24]使用山中因子治療衰老鼠7或10個月后，發現衰老鼠腎臟和皮膚細胞的表觀遺傳學模式更接近年輕小鼠，同時發現衰老鼠的多項生理指標均呈年輕化。綜上，表觀遺傳年齡可發現并預測各種內源或外源性因素對人體衰老生物學過程的影響，由于表觀遺傳變化具有可逆的重要特性，這使得通過表觀遺傳調控干預衰老或衰老相關疾病成為一種新的途徑。

3 表觀遺傳年齡與心血管疾病

心血管疾病是最常見的年齡相關疾病之一，其發病與血管過早老化導致的內皮功能障礙密切相關。通常認為，表觀遺傳調控參與了多種心血管疾病的發病過程[25]。DNA甲基化可通過修飾特定基因的啟動子，使特定基因表達下調來調控心臟功能。如編碼血管緊張素轉化酶2的基因啟動子，甲基化程度減低可影響基因表達引起高血壓[26]。又如DNA甲基化被證明參與了缺血性心肌病心肌細胞的代謝重編程過程[27]。而血管老化的結構功能改變，也被認為涉及了廣泛的表觀遺傳調控機制[28]。表觀遺傳調控對于心血管疾病風險重要性的研究來自于英國前瞻性代謝研究[29]。在本研究中，與接受標準治療的糖尿病患者相比，接受早期強化治療的糖尿病患者后期心血管并發癥及不良事件發生率更低。而既往有血糖控制不良病史的患者，盡管后期接受了強化降糖治療，仍表現出糖尿病腎病和視網膜病變的進展，以上現象提示糖尿病患者具有“代謝記憶”，即在糖尿病早期進行良好的血糖控制而產生的代謝記憶很可能未來對患者帶來更多的心血管保護獲益。并且，研究指出表觀遺傳調控可能參與了糖尿病慢性炎癥性血管病變的發病過程。

近年來，已有多項研究表明，表觀遺傳年齡也與心血管疾病風險之間存在著密切關聯。隨著表觀遺傳年齡的增長，每年心血管疾病的發病風險上升約4%[30]。2016年，來自德國的ESTHER隊列研究入選了1 863例平均年齡62.5歲的老年患者，利用Horvath時鐘計算了研究對象的表觀遺傳年齡與實際年齡的差值，發現表觀遺傳年齡加速與心血管疾病死亡率呈正相關，表觀遺傳年齡加速的差值每增加5年，因心血管疾病死亡的概率增加約20%[31]。并且，Roetker等[32]在2018年的Circulation雜志上發表了表觀遺傳年齡加速與心血管疾病風險之間關系的文章，對社區動脈粥樣硬化風險ARIC研究的2 543例參與者進行了表觀遺傳年齡的測量。參與者平均年齡為57歲，在參與者中，表觀遺傳年齡加速或減速的年齡跨度為8～9年。研究隨訪的心血管疾病風險包括急性冠狀動脈綜合征、心力衰竭、外周動脈疾病和致命性冠心病事件等。有研究[32]證明，表觀遺傳年齡加速與經典的心血管風險因素如男性、吸煙和糖尿病呈正相關。表觀遺傳年齡加速每增加5年，參與者發生心血管事件的風險增加10%～20%，其中與致命性冠心病事件的關聯最為顯著，而利用Hannum時鐘測量的表觀遺傳年齡加速與心血管疾病的風險關聯更為緊密[32]。因此，基于DNA甲基化水平的表觀遺傳時鐘作為精準的生物年齡評估方法，未來有望成為一種了解年齡相關心血管疾病風險機制的工具而得到更多的實踐應用。

4 表觀遺傳年齡與心血管疾病的相關機制

越來越多的證據[33]表明，衰老細胞在參與心臟重構和心功能障礙的過程中起著重要作用。細胞衰老被認為是一種由重復復制導致的端粒損耗或其他形式的細胞氧化應激所誘導的病理狀態[34]。氧化應激使細胞內活性氧自由基生成與消除失去動態平衡，隨著衰老加劇，最終導致細胞廣泛的DNA損傷，引發基因突變及表觀遺傳改變。在這種狀態下，細胞會經歷持久的細胞周期停滯以及功能下降，并出現促炎癥表型。氧化應激和炎癥誘導的細胞應激將導致心肌細胞加速衰老。隨著年齡增長，這些衰老細胞在心肌組織中逐漸積累，對臨近細胞產生有害的旁分泌作用，從而對組織器官產生系統性影響。這些作用由促炎因子、蛋白酶以及一些細胞外基質成分的分泌介導，其中包括內皮素-3、轉化生長因子β2和生長分化因子15等，又被稱為衰老相關分泌表型。衰老相關分泌表型信號通路促進炎癥和其他細胞的死亡衰老[35]。有研究[36]表明，誘導衰老加速的小鼠可產生明顯的心肌細胞死亡、肥大和心力衰竭，而減緩衰老能起到心臟保護作用。既往多項研究已表明，表觀遺傳調控，尤其是甲基化調控在心血管疾病的發生和發展中起著重要作用。表觀基因組關聯分析研究[37]顯示，心力衰竭患者左心室心肌細胞基因組啟動子CpG島較健康對照組存在著明顯差異。在去甲腎上腺素誘導的大鼠心肌肥大細胞中，發現了DNA高甲基化，可能與心臟中活性氧生成升高相關[38]。另外，有研究[39]顯示，由m6A甲基化酶介導的N6-甲基腺苷甲基化也可誘導代償性心肌肥厚，以上提示了甲基化改變和心血管疾病發病之間的密切聯系。

目前，表觀遺傳年齡與衰老相關心血管疾病發病機制之間的具體關聯尚未完全闡明。有研究[40]指出，年齡相關的免疫系統衰老以及長期伴隨的的慢性低度炎癥與心血管疾病發病高度相關，通過表觀遺傳年齡測量可能捕捉到細胞基因功能的微妙變化。因此，衰老表觀遺傳基因調控目前已成為一個新興的研究領域[41]。全基因組關聯研究從1萬多例成人的外周血白細胞DNA樣本中，發現8個與表觀遺傳年齡加速相關的基因。其中，端粒酶逆轉錄酶基因與衰老的關系最為密切。表觀遺傳年齡加速與端粒長度縮短顯著相關，轉染端粒酶逆轉錄酶基因的細胞可表現為持續生長及表觀遺傳衰老延遲[42]。因此，與端粒酶生物學相關的表觀遺傳年齡加速和心血管疾病發病機制的關聯可作進一步研究。另外，有研究[43]發現，表觀遺傳年齡測量所包含的CpG集合中，甘丙肽受體CpG位點的甲基化差異與心血管疾病發生存在一定關聯，該受體是一種神經肽受體，主要表達于大腦和脊髓，在心臟中也有一定表達。未來隨著單細胞測量技術和基因組分析技術的快速發展，能更好地實現在細胞水平上測量與表觀遺傳衰老相關分子的精細變化[44]。表觀遺傳年齡變化作為一項新的干預靶點，目前基礎研究仍很缺乏，未來需實施多樣化的體內及體外研究，以提供更多與年齡相關心血管疾病風險的實驗證據。

5 表觀遺傳年齡的應用

衰老和與年齡相關慢性疾病涉及到許多與時間相關的生物學因素的影響，內源性因素比如DNA損傷、基因表達改變、氧化應激、線粒體損傷以及端粒改變等；外源性如營養、生活方式以及環境條件改變等，目前對衰老機制的理解仍處于新興階段，認為是受多種生物機制影響的復雜生物網絡[45]。其中，由于多種生物學因素的影響，使細胞受到一系列表觀遺傳學調控而影響基因組表達，而隨著年齡增長或不良生活方式的影響，可能使細胞表觀遺傳時鐘加速(即表觀遺傳漂變)，加速器官功能性衰老，使個體更容易罹患疾病，即環境-基因相互作用在心血管疾病的發生風險中起著重要作用[46]。監測機體衰老的表觀遺傳學特征有助于發現疾病病因及環境風險因素，而注重飲食、運動及健康生活方式調整，將產生潛在的表觀遺傳學干預，達到預防及管理疾病的目的，有利于人體健康和良性衰老。Hahn等[47]發現，通過熱量限制可預防小鼠衰老相關的DNA甲基化變化；又如，吸煙既是心血管疾病的風險因素，也是加速機體衰老的來源之一[48]。有流行病學證據表明，戒煙可逆轉一些年齡相關變化，戒煙者患心血管疾病的風險隨時間推移而下降。而評估吸煙者DNAm年齡和相關的基因組甲基化數據，可幫助識別吸煙相關的心血管事件背后的與年齡相關的甲基化標記[49]。然而，通過改善生活方式減緩或逆轉表觀遺傳加速的機制及預防心血管疾病風險的效果仍需進行更多臨床隊列研究評估。DNAm年齡作為重要的預后生物標志物，一些金融保險領域已將其用于預測患者心血管疾病風險和死亡率，以及評估醫療保險費用。未來有望轉化在更多的臨床和公共衛生領域，如量化生物年齡用于預測心血管疾病的風險并發現新的治療靶點，以及評估患者生物年齡及制定個體化治療處方等。通過DNAm年齡比傳統方法能更好地識別心血管疾病的高危人群和實施對應的預防保護策略，在未來的醫療實踐中具有重要意義。

6 總結和展望

表觀遺傳調控在衰老及衰老相關疾病的發生和發展過程中發揮重要作用。表觀遺傳年齡作為一種能精確地評估個體生物年齡的標志物，為衰老及衰老相關疾病的分子研究提供了有前景的新方向。年齡是心血管疾病重要的危險因素之一，對患者納入表觀遺傳年齡評估有助于發現心血管疾病的相關風險，并達到早期干預和改善預后的目的。未來需進行更多研究了解表觀遺傳年齡與心血管疾病致病機制的關聯，以發現新的治療靶點并指導個體化治療，使更多的心血管疾病患者獲益。