王琪，彭超，周衛強，唐堂，何太波，裴成利,梁穎超，武麗達，李凡，李義，佟毅*

（1.中糧營養健康研究院有限公司，北京 102209；2.營養健康與食品安全北京市重點實驗室，北京 102209；3.老年營養食品研究北京市工程實驗室，北京 102209；4.中糧生物科技股份有限公司，安徽蚌埠 233010；5.玉米深加工國家工程研究中心，吉林長春 130033）

隨著經濟的快速發展，我國居民生活水平不斷提升，膳食結構方面也出現了較大的變化，導致糖尿病、肥胖和心腦血管等疾病的發病率不斷攀升。國際糖尿病聯盟2017年統計數據顯示，中國擁有高達1.14億成人糖尿病患者，占世界成人糖尿病患者總數的25%以上，位居世界第一[1]。此外，近年來我國肥胖率和超重率逐年增長且均處于較高水平，張興華等[2]通過對2002—2019年采集的115個族群中6萬多名成人體質指標進行質量指數分析發現，男性和女性超重比分別高達29.6%和30.0%，肥胖率高達11.8%和14.0%。日益升高的疾病發生率引起了人們對于飲食健康的密切關注，同時隨著人們生活品質的提高，人們對于食物口感也有了較高的標準，尋求口感好熱量低的甜味劑逐漸成為人們的重要需求點。稀有糖是自然界存在的稀少單糖及其衍生物，有益于人體健康，且具備獨特功能。其中，稀有糖中的阿洛酮糖是一種低熱量甜味劑，在自然界中的含量極少，一般存在于小麥、水果和各種其他食物中。阿洛酮糖擁有70%的蔗糖甜度，熱量卻只有蔗糖的0.3%[3-4]。D-阿洛酮糖不僅甜度適中、熱量極低，還具有降血糖、抗炎、神經保護和免疫抑制等多種藥理功效。微生物法合成D-阿洛酮糖是指在微生物菌株內表達酮糖3-差向異構酶，包括D-阿洛酮糖3-差向異構酶（D-psicose 3-epimerase，DPE）或D-塔格糖3-差向異構酶（D-tagatose 3-epimerase，DTE），它們以果糖作為底物進行催化，進而產生D-阿洛酮糖（圖1），因此酮糖3-差向異構酶是微生物法合成D-阿洛酮糖的關鍵酶。本文綜述了微生物法生產阿洛酮糖的綠色制造工藝的研究進展，主要包括阿洛酮糖特性及功能，生產阿洛酮糖關鍵酶的特性，菌株構建、發酵生產工藝及分離純化和結晶工藝，以期為阿洛酮糖的后續研究和工業生產提供技術支持。

圖1 果糖與阿洛酮糖異構關系圖

1 阿洛酮糖生理功能及機制研究進展

阿洛酮糖在緩解改善糖尿病、降血脂、保護心腦功能等方面都有重要的生理作用。PRATCHAYASAKUL等[5]研究發現D-阿洛酮糖可以減輕腦氧化應激，降低腦線粒體活性氧的產生及海馬細胞凋亡，改善腦胰島素不敏感性和海馬細胞突觸功能障礙，從而改善糖尿病前期大鼠的學習過程。PONGKAN等[6]開展了D-阿洛酮糖對肥胖誘導的胰島素抵抗大鼠的心臟和心臟線粒體功能影響的研究，發現3%D-阿洛酮糖降低了大鼠體重、內臟脂肪、血漿膽固醇，在心率變異性和減輕心臟線粒體功能障礙方面具有一定的療效，最終能夠使心臟功能得到改善。IWASAKI等[7]的研究表明D-阿洛酮糖會誘導胰高血糖素樣肽1受體激動劑GLP-1釋放，進而激活迷走神經的傳入信號，減少食物攝入并提高葡萄糖耐量，因此阿洛酮糖可通過迷走神經傳入來控制進食和高血糖，從而改善暴飲暴食所致的肥胖和糖尿病。GOU等[8]研究發現，D-阿洛酮糖可以通過減少促炎細胞因子的產生來調控脂聯素分泌，增強肌肉中的胰島素信號和Glut-4表達進而減輕Wistar大鼠HFD誘導的胰島素抵抗。在改善肥胖方面，WEI等[9]研究發現，D-阿洛酮糖還可以通過在特定條件下促進肌細胞的凋亡來改善肥胖，D-阿洛酮糖對C2C12（小鼠生肌細胞）沒有直接毒性，然而在低劑量H2O2誘導的細胞內活性氧（ROS）存在下，D-阿洛酮糖誘導C2C12細胞損傷并以劑量依賴性方式顯著降低C2C12細胞活力，進而使細胞凋亡水平和ROS的產生增加，而線粒體膜電位（MMP）降低，最終對肌肉細胞產生毒性作用。在控制脂代謝方面，HAN等[10]的研究表明5%的阿洛酮糖可以通過降低小鼠小腸中CD36、ApoB48、FATP4的mRNA表達來降低血漿和肝臟脂質，同時升高糞便脂質，還能夠通過脂質調節酶活性使肝臟脂肪酸合成酶和β-氧化活性下降，使得飲食性肥胖的代謝狀態正常化。LEE等[11]研究阿洛酮糖對C57BL/KsJ db/db小鼠的高血糖、高胰島素血癥、糖尿病和炎癥反應的影響時發現，阿洛酮糖可以顯著增加肝葡萄糖激酶的活性，降低肝磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶和葡萄糖-6-磷酸酶的活性。此外，D-阿洛酮糖還能有效降低血漿和肝內的甘油三酸酯和游離脂肪酸水平，降低肝脂肪酸氧化和肉堿棕櫚酰轉移酶活性，降低血漿中促炎性脂肪因子和細胞因子的水平等方式來綜合改善脂質和糖代謝。綜上，阿洛酮糖主要是作為激活劑等引發細胞內進行一系列的信號轉導，從而對脂代謝和血糖代謝通路等起到一定的調控作用。

2 阿洛酮糖的生產工藝簡述

D-阿洛酮糖的制備方法主要包括了生物轉化法和化學法等。其中，化學法是通過環轉換合成法、催化加氫法和加成反應法等化學手段來制備阿洛酮糖的方法，此類方法成本高且立體選擇性較差，具有一定的化學污染，因此應用受限。利用一種或多種酶催化底物生成目標產物的生物轉化法由于具有反應條件溫和、低毒環保、環境相容性好等優勢已經成為目前阿洛酮糖合成的主流方式。生物法生產阿洛酮糖的工藝主要涵蓋了D-阿洛酮糖差向異構酶基因挖掘與篩選、用于生產D-阿洛酮糖差向異構酶的工程菌株構建、菌株的發酵優化及擴大培養、所得菌株中酶的提取分離、酶促反應將果糖轉化成D-阿洛酮糖、D-阿洛酮糖的分離純化以及產物結晶，最終得到高純度的阿洛酮糖晶體。其中，菌株構建與酶的表達、產物分離純化及結晶等是關鍵環節，阿洛酮糖的具體生產工藝流程如圖2所示。

圖2 生物法合成阿洛酮糖的工藝流程

2.1 阿洛酮糖生產相關酶的來源與性質

酮糖3-差向異構酶（KE）可逆催化酮糖之間的差向異構化，將酮糖轉化為阿洛酮糖，因此是生物法生產阿洛酮糖的有效工具。目前不同微生物來源常用酶根據底物的不同主要分為D-阿洛酮糖3-差向異構酶和D-塔格糖3-差向異構酶，國內外學者陸續發現了來自不同菌株的D-阿洛酮糖3-差向異構酶和D-塔格糖3-差向異構酶（如表1所示）[12-18]。

表1 不同來源的阿洛酮糖差向異構酶性質的比較

由表1可以看出，兩種酮糖3-差向異構酶大多依賴于金屬離子Co2+和Mn2+，Co2+離子適宜pH一般在7.5～8.0，適宜溫度在50～70℃，Mn2+離子適宜pH一般在7.5～8.5，適宜溫度在35～55℃，且對D-果糖具有良好的催化活性。WANG等[16]開發的Escherichia coli來源的金屬依賴性酶是為數不多的對Ni2+顯示出最高活性的酶，較低濃度的Ni2+能夠使酶提高耐熱性。該酶表現出較為寬泛的pH和溫度范圍，在pH值為6.0、溫度為50 ℃條件下活性最大，達到30%的轉化率。QI等[15]發現的R. sphaeroide來源阿洛酮糖差向異構酶在低溫下催化反應效果最好，最佳溫度為35 ℃，而當溫度＞40 ℃時活性開始下降。而PATEL等[17]開發的差向異構酶在高溫（75～80 ℃）時表現出最佳的催化效果，在最佳條件下，700 mg/mL D-果糖的酶促處理能產生約217 mg/L的D-阿洛酮糖。工業生產中阿洛酮糖高產需要高酶活的阿洛酮糖差向異構酶，因此開發高催化活性的酶仍然是現階段的難點。

2.2 阿洛酮糖差向異構酶生產工程菌株的表達體系

目標酶的表達離不開宿主菌體，將所發掘的不同來源的阿洛酮糖異構酶基因序列片段連接到載體上，再將載體導入到宿主菌株中進行發酵培養，才能實現阿洛酮糖差向異構酶的表達，因此發酵菌株的構建及酶表達是生物法生產阿洛酮糖工藝中的關鍵環節。阿洛酮糖差向異構酶生產中常見的表達體系主要包括枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和酵母菌。

2.2.1 枯草芽孢桿菌表達體系

枯草芽孢桿菌是自然界中廣泛存在的一種產芽孢革蘭氏陽性菌，其安全性好，既不含內毒素也不分泌外毒素，被美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）認定為生物安全菌株。枯草芽孢桿菌由于具備一定的蛋白分泌能力，在發酵工業生產中常被用來生產異源蛋白，且在α-淀粉酶、β-甘露聚糖酶、人類白介素-3和脂肪酶等產品生產上已經獲得突破[18-19]。目前，枯草芽孢桿菌也常被用于表達阿洛酮糖差向異構酶的菌株載體，且已有諸多枯草芽孢桿菌表達阿洛酮糖差向異構酶的相關研究。賈敏等[20]將利用聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）擴增后的阿洛酮糖3-差向異構酶基因與枯草芽孢桿菌載體pMA5連接，構建出重組質粒，在質粒轉入枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，WB800）感受態細胞中經篩選鑒定得到了D-阿洛酮糖差向異構酶重組菌株。研究表明，該菌株產生阿洛酮糖差向異構酶最適pH為7.0，其中最適溫度為55 ℃，18 h時酶活可達6.8 U/mL。溫宇威等[21]以枯草芽孢桿菌為宿主，在克隆了D-阿洛酮糖3-差向異構酶基因后，將基因的上游加入了P43啟動子,再將形成的特定基因序列連接到pMA5載體上構建出雙啟動子表達DPE家族酶的表達系統，結果發現重組高效表達的DPE的最適溫度為55 ℃，最適pH為7.0，在溫度30～40 ℃和pH 6.5～7.5范圍內穩定性好，以D-阿洛酮糖為底物對應的Km為26.68 mmol/L，催化效率 Kcat/Km為 95.8 L/（mmol·min）。CHEN 等[22]將瘤胃球菌屬的阿洛酮糖差向異構酶在枯草芽孢桿菌中成功表達，在比較3種糖誘導型啟動子后，發現了木糖誘導型啟動子PxylA生產阿洛酮糖差向異構酶是最有效的啟動子。基于誘導物濃度和阿洛酮糖差向異構酶表達的分析，推測細胞內阿洛酮糖差向異構酶表達與木糖積累水平間的相關性，在經過分析優化后將最佳木糖誘導濃度從4.0%降低到0.5%，此時阿洛酮糖差向異構酶在7.5 L發酵罐中補料分批發酵的表達水平達到了95 U/mL和2.6 g/L。孫帆等[23]對來源于解纖維素梭菌的阿洛酮糖差向異構酶基因在枯草芽孢桿菌中進行產酶活性研究，發現在3 L發酵體系中高密度發酵的終點酶活可高達495 U/mL，得到高表達量阿洛酮糖差向異構酶的發酵液，以硅藻土-海藻酸鈉為材料對發酵液的重組細胞進行固定化研究，發現連續反應多批次后轉化率仍然為28%，且可保持殘余酶活為81%。FU等[24]從瘤胃球菌中克隆了D阿洛酮糖3-差向異構酶，并在枯草芽孢桿菌A311中表達。發酵調控方法采用兩步pH分段調節方法，即發酵前24 h維持發酵液pH值為7.0，后24 h維持pH值為7.5，該方法顯著提高了阿洛酮糖差向異構酶產量并降低了發酵成本，結果表明阿洛酮糖差向異構酶產量為74 U/mL，是對照組的2.5倍。綜上，枯草芽孢桿菌-阿洛酮糖差向異構酶構建及表達體系日趨成熟，菌株的構建方法及發酵的調控方式呈現多樣化，表達的阿洛酮糖差向異構酶均維持在較高水平。

2.2.2 大腸桿菌表達體系

大腸桿菌不但成本低廉、繁殖較快，而且外源蛋白的表達量較高，同時也具備了利于同位素標記技術應用以及適用范圍廣等諸多優勢，因此常被應用于外源蛋白表達研究。目前，大腸桿菌被用于阿洛酮糖差向異構酶的載體表達的研究已取得一定的進展，周衛強等[25]對異源表達D-阿洛酮糖3-差向異構酶工程大腸桿菌在5 L罐進行發酵培養，并系統探究了該菌株表達D-阿洛酮糖差向異構酶的誘導工藝，結果表明誘導后溫度25 ℃、pH 7.0、IPTG誘導劑濃度0.5 mmol/L為發酵工藝的最優條件，發酵所得阿洛酮糖差向異構酶在酶促反應30 min平衡轉化率可達28%左右。PARK等[26]研究發現，在Terrific Broth（TB）培養基中培養重組大腸桿菌細胞24 h時，表達來自根癌農桿菌的雙位點變體（I33LS213C）D-阿洛酮糖3-差向異構酶的比活性較高，24 h后重組大腸菌株中粗蛋白和阿洛酮糖差向異構酶的表達含量分別為37.0%和8.6%。通過研究發現重組大腸菌株在60 ℃、pH 8.5、細胞濃度為4 g/L和果糖700 g/L條件下最有利于用D-果糖生產D-阿洛酮糖，大腸菌株酶促反應40 min可產生230 g/L D-阿洛酮糖，轉化率為33%，容積生產率為345 g/（L·h），比生產率為86.2 g/（g·h）。袁堂國等[27]構建了異源表達Flavonifractor plautiiD-阿洛酮糖3-差向異構酶的重組大腸桿菌用于轉化果糖，以實現D-阿洛酮糖的全細胞生物合成。結果表明，pH 7.5、65 ℃為重組菌株酶解反應最優條件，且在不添加金屬離子時，半衰期達到2.7 h；D-果糖水溶液中加入濃度為2.4 g/L菌液反應，所得D-阿洛酮糖的濃度為231 g/L，轉化率可達33%，在體系額外加入硼酸根離子后，D-阿洛酮糖終濃度可提升至378 g/L，轉化率高達63%。溫俊婷等[28]嘗試在大腸桿菌Rosetta（DE3）體系中分別過表達D-阿洛酮糖3-差向異構酶、L-鼠李樹膠糖激酶（RhaB）和多聚磷酸鹽激酶（PPK）,并將3種酶偶聯生產阿洛酮糖并計算產率。結果顯示，將DPE和RhaB雙酶偶聯反應，在pH 8.5、溫度35 ℃，DPE和RhaB酶量比為1∶2，且加入微量Mg2+條件下反應最優，此條件下的阿洛酮糖得率可高達70%；將DPE、RhaB和PPK 3酶偶聯進行反應，ATP濃度降低80%，反應成本得到進一步降低，但D-阿洛酮糖得率僅為50%。綜上，大腸桿菌易遺傳改造且便于發酵培養，是目前生產阿洛酮糖差向異構酶等的重要宿主菌株，通過代謝工程策略的不斷研究會更加理性地改造大腸桿菌菌株，這將為生物法高效生產阿洛酮糖提供更新的工藝。

2.2.3 酵母菌表達及催化體系

酵母表達系統有眾多品質優良的宿主菌株，其不僅經濟節約、耐熱性優異，且能利用多種能源物質，還能快速提高密度并產生蛋白。隨著研究的不斷深入，酵母菌株也逐漸被應用于阿洛酮糖差向異構酶的表達場所或是提供D-阿洛酮糖差向異構酶催化的場所。朱星星等[29]采用基因工程手段將連有D-阿洛酮糖3-差向異構酶基因的載體在馬克斯克魯維酵母工程菌株中高效表達，并進行全細胞反應條件優化及酶學特性研究，研究表明濃度為10 g/L的馬克斯克魯維酵母菌株最優催化條件為溫度55 ℃、pH 8.0，此條件下可將750 g/L的D-果糖催化產生190 g/L的D-阿洛酮糖。LI等[30]利用釀酒酵母孢子固定了來源于嗜熱細菌和根癌農桿菌的木糖異構酶和D-阿洛酮糖差向異構酶，接著在孢子固定化酶的催化作用下完成從底物D-葡萄糖到D-阿洛酮糖的轉化，最高轉化率達到12.0%。綜上，酵母菌不僅在表達阿洛酮糖異構酶上具有一定優勢，作為進行下游酶促反應的場所來固定酶也可以實現阿洛酮糖的高產。

2.3 阿洛酮糖的分離純化

通過菌株發酵培養表達得到的阿洛酮糖差向異構酶，以果糖作為底物，在一定的反應條件下通過對果糖異構化的催化反應從而得到D-阿洛酮糖。但由于阿洛酮糖3-差向異構酶催化果糖的異構化反應屬于可逆反應，化學反應平衡時仍混有果糖，因此需要進一步進行阿洛酮糖的分離純化。但阿洛酮糖和果糖這兩種糖互為差向異構體，其物理性質、化學性質十分相近，因此分離難度很大，目前常采用色譜分離法進行分離，其中主要包括離子交換樹脂和模擬移動床色譜等。

（1）模擬移動床分離具有自動化程度高、分離效率高、操作費用小等優勢，常用于糖工業的分離。如任世闊等[31]通過移動床色譜對混有葡萄糖、果糖及低聚糖的糖混合液進行分離，獲得質量分數大于80%的阿洛酮糖溶液。冉淦僑等[32]利用D-果糖與固定化D-阿洛酮糖差向異構酶納米微球反應，制備D-阿洛酮糖與果糖的混合液，在脫色預處理后將混合液按照順序式模擬移動床的特定分離參數進行分離，得到的D-阿洛酮糖溶液的純度超過99%，回收率超過95%。由此可見模擬移動床分離效率高，有助于阿洛酮糖的連續化生產。

（2）離子交換樹脂操作簡便、分離速度快，不使用有毒有害的有機萃取劑及溶劑，性能穩定、可反復使用，因此也被應用于阿洛酮糖的分離。LI等[33]使用葡萄糖異構酶和葡萄糖氧化酶以果糖作為底物進行分步酶催化反應，在阿洛酮糖和果糖的混合糖液中的果糖轉化為葡萄糖酸后，利用離子交換樹脂將葡萄糖酸分離出去，最終得到純度為91.2%的阿洛酮糖。邢慶超等[34]采用陰（陽）離子交換樹脂將生物法得到的D-阿洛酮糖進行脫色脫鹽，接著采用DTF-Ca2+型離子交換樹脂進行后續分離純化，研究發現柱溫為60 ℃、進樣量為10 mL、流速為1 mL/min時分離效果最佳，經液相色譜檢測，發現分離產物中D-阿洛酮糖純度可達98.3%。

（3）還可以利用生物發酵法純化阿洛酮糖。釀酒酵母在有氧環境下能夠以混合糖液中的D-葡萄糖或D-果糖為能量來源生成二氧化碳，同時對D-阿洛酮糖含量沒有明顯影響，汪俊卿等[35]依據此原理開發出一種提高混合糖液中阿洛酮糖含量的方法，該方法既能夠除去D-葡萄糖和D-果糖，又能除掉阿洛酮糖加熱濃縮中產生的色素，大幅提高了阿洛酮糖的純度。

2.4 阿洛酮糖結晶工藝

經分離純化后的阿洛酮糖經過干燥結晶工藝才能得到易于貯藏的阿洛酮糖晶體，受熱的阿洛酮糖易發生玻璃化轉變，因此結晶難度較大，難以通過加熱干燥等方式制得干品，是目前制約阿洛酮糖在貯存運輸方面的關鍵問題。郭元亨等[36]嘗試在乙醇體系中優化阿洛酮糖的結晶，研究發現在D-阿洛酮糖溶液密度為1.35 g/mL、D-阿洛酮糖溶液與乙醇比例為1.0∶3.8、結晶時間325 min、結晶溫度25 ℃的結晶條件下對阿洛酮糖進行初次結晶，收率可達71.58%。在常規的結晶工藝中，阿洛酮糖溶液飽和濃度高、黏度大，導致結晶困難、晶型細小、晶體分布不集中以及阿洛酮糖收率較低等問題。杜倩等[37]采用蒸發結晶法和降溫結晶法相結合的阿洛酮糖結晶方法，依次經過蒸發結晶、整晶與降溫結晶過程最終制備得到了阿洛酮糖晶體，其晶體目數分布集中，且80%以上的晶體尺寸均在40～60目。目前，阿洛酮糖結晶工藝較為煩瑣，如何將工藝化繁為簡，減少有機試劑添加量，進一步提高阿洛酮糖結晶度，獲得大小形狀合適的晶體，將是提高阿洛酮糖晶體純度的關鍵，因此結晶工藝仍有很大的瓶頸需要突破。

3 結語

隨著生活品質的提高，人們對于健康飲食的關注度日益增大，我國人口基數龐大，對于功能糖產品的需求量很高，因此阿洛酮糖具有很大的市場開發潛力。但目前阿洛酮糖的生產技術仍存在一些技術壁壘，較難實現工業化生產，其主要原因有以下幾點：（1）差向異構酶活較低，要加大菌株研發力度，構建出穩定產出高酶活值的菌株，阿洛酮糖結晶難度大，目前結晶相關的研究，突破難度大；（2）阿洛酮糖的生產大多以果糖為底物，果糖成本較高，開發低廉的菌株發酵配方將有助于降低阿洛酮糖的工業生產成本；（3）我國阿洛酮糖法規申報工作滯后，市場拓展方面有欠缺。相信隨著國家對阿洛酮糖生理功能研究和臨床試驗探索的逐步深入以及法規申報制度的日益完善，阿洛酮糖生產工藝會得到進一步的提升，它將逐漸走入人們的生活，走上百姓的餐桌。