天胡荽中槲皮素與山奈酚的含量測(cè)定

陳莉，羅穎，范俊

(湖北科技學(xué)院 藥學(xué)院,湖北咸寧 437100)

天胡荽為傘形科天胡荽屬植物，多生長(zhǎng)在濕潤(rùn)的草地、河溝邊、林下等，海拔475～3 000 m[1]。天胡荽具有清熱解毒、利尿消腫的功效[2]。內(nèi)服可治療咽喉炎、急性腎炎、小便不利、急性黃疸型肝炎等，外敷可用于帶狀皰疹、濕疹、腳癬、癰疽疔瘡、丹毒等[3]。

天胡荽中化學(xué)成分主要為黃酮苷、揮發(fā)油、香豆精、氨基酸類等[4-5],具有抗病毒、肝損傷保護(hù)、抗腫瘤等多種藥理活性[6]。該植物中的山奈酚（kaempferol）與槲皮素（quercetin）具有較強(qiáng)的抗氧化、抗炎、抗增殖性質(zhì)和免疫調(diào)節(jié)等作用[7-8]。本文建立了一種測(cè)定天胡荽中槲皮素與山奈酚含量的高效液相色譜法，為天胡荽的質(zhì)量研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器

LC300高效液相色譜系統(tǒng)，北京清博華科技有限公司；BP211D電子天平（精度0.1 mg），德國(guó)賽多利斯公司。

1.2 試劑

槲皮素，HPLC＞98.0%，北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司；山萘酚，93.8%，中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈與甲醇，色譜純，美國(guó)Thermo Fisher公司；蒸餾水，深圳屈臣氏蒸餾水有限公司。天胡荽采自湖北省通城縣，經(jīng)鑒定為傘形科天胡荽亞科植物天胡荽的全草。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 混合對(duì)照品溶液的制備

取槲皮素與山奈酚適量，用甲醇溶解，制得含槲皮素100.3 μg/mL，山奈酚100.5 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

1.3.2 供試品溶液的制備

精密稱取天胡荽藥材粉末（約0.5 g），置50 mL圓底瓶中，加入20 mL溶劑（甲醇與25%鹽酸體積比為4∶1），記錄總重量，置于80 ℃的水浴中加熱回流1.0 h，待冷卻后用分析天平稱量總重量，加入上述溶劑以補(bǔ)充損失的重量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，得供試品溶液。

1.3.3 色譜條件

ODS色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈（A）和0.40%磷酸（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫：0～ 5 min，30%A；5～ 20 min，30% ～ 50%A；20～25 min，30%A；柱溫30.0 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)368 nm；進(jìn)樣量20 μL。此條件下天胡荽供試品中各組分峰形較好，共存成分不干擾槲皮素與山奈酚的檢測(cè)。所得HPLC色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)條件下標(biāo)準(zhǔn)品與樣品色譜圖

1.3.4 方法學(xué)考察

（1）線性關(guān)系考察。移取1.3.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL和5.00 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇定容，混勻，按1.3.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，濃度（C）為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）加樣回收實(shí)驗(yàn)。取9份已知含量天胡荽藥材粉末（批號(hào)為20200502）約0.25 g，精密稱定后置于圓底瓶中，分別加入1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL混合對(duì)照品溶液，按1.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按1.3.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算回收率。

（3）精密度實(shí)驗(yàn)。將1.3.2項(xiàng)下配置的供試品溶液，按1.3.3項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積。

（4）穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。將供試品溶液于常溫下放置0 h、2 h、4 h、8 h、12 h和24 h后進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積。

（5）樣品含量測(cè)定。將采摘的天胡荽藥材陰干后打粉，干燥至恒重。按1.3.2項(xiàng)下方法制備得供試品溶液，按1.3.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品中槲皮素與山奈酚的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系考察

HPLC檢測(cè)天胡荽中槲皮素與山奈酚的線性關(guān)系為：槲皮素A=169.16C-460.30，r=0.999 7；山奈酚A=136.20C-291.14，r=0.999 6。結(jié)果表明，在濃度分別為2.51～50.15 μg/mL和2.51～50.25 μg/mL時(shí)，槲皮素與山奈酚線性關(guān)系良好。

2.2 加樣回收實(shí)驗(yàn)

天胡荽中槲皮素與山奈酚的加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1、表2。槲皮素的加樣回收率RSD值為1.60%（n=9），山奈酚的加樣回收率RSD值為1.97%（n=9），表明方法準(zhǔn)確度良好。

表1 槲皮素回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=9）

表2 山奈酚回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

槲皮素的質(zhì)量含量測(cè)定結(jié)果依次為0.051 9%、0.051 2%、0.052 9%、0.052 3%、0.051 9%和0.052 7%，RSD=1.19%（n=6）；山奈酚的質(zhì)量含量測(cè)定結(jié)果依次為0.095 6%、0.096 7%、0.095 4%、0.094 6%、0.097 2%和0.097 6%，RSD=1.21%（n=6），方法精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，天胡荽中槲皮素的質(zhì)量含量測(cè)定結(jié)果0.051 9%、0.052 1%、0.051 2%、0.051 8%、0.050 9%和0.050 4%，RSD=1.29%（n=6）；山奈酚的質(zhì)量含量測(cè)定結(jié)果依次為0.095 6%、0.097 2、0.095 2%、0.096 4%、0.094 1%和0.093 6%，RSD=1.43%（n=6）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 樣品含量測(cè)定

天胡荽中槲皮素與山奈酚的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。表中兩批天胡荽樣品均采自同一地方，但采集時(shí)間不同，放置時(shí)間不同，測(cè)定結(jié)果差異較大。

表2 天胡荽中槲皮素與山奈酚的質(zhì)量含量（n=3）

2.6 討論

（1）預(yù)實(shí)驗(yàn)研究中，比較了乙腈-水和乙腈-磷酸水溶液為流動(dòng)相的色譜分離情況，發(fā)現(xiàn)在流動(dòng)相中添加磷酸可改善峰形；比較了等度洗脫和梯度洗脫，綜合考慮出峰時(shí)間與分離效果，采用2.1項(xiàng)下梯度洗脫方式；檢測(cè)出未知成分（11.7 min），樣品中槲皮素峰（13.7 min）與該未知成分可較好分離，峰形與出峰時(shí)間均較佳。

（2）掃描槲皮素、山奈酚對(duì)照品溶液的紫外光譜，在270 nm、368 nm均有吸收，其中270 nm吸收相對(duì)較強(qiáng)，但在368 nm處測(cè)定含量時(shí)干擾少，色譜基線更穩(wěn)定，因此選用368 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

（3）本試驗(yàn)天胡荽分別于2020年4月初和5月初采自湖北省通城縣。因藥材受產(chǎn)地、采收時(shí)間、貯存時(shí)間長(zhǎng)短等因素影響，含量差異較大，其具體情況還有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

建立了測(cè)定天胡荽中槲皮素和山柰酚含量的HPLC方法。結(jié)果表明，槲皮素和山柰酚與天胡荽中其他成分分離良好；在2.51～50.15 μg/mL和2.51～50.25 μg/mL時(shí)，兩種成分的濃度與峰面積線性關(guān)系良好；平均加樣回收率分別為99.7%（RSD=1.60%）和100.3%（RSD=1.97%）。該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，適用于天胡荽中槲皮素和山柰酚的含量測(cè)定。