shRNA靶向干擾SMG-1表達對鼻咽癌細胞放射敏感性的影響

潘 雅，黃家軍，黃繼紅，蘇炳澤，王海妹，陳賽明

(海南醫學院第一附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科，海口 570203)

鼻咽癌是廣東等地區的常見惡性腫瘤，多數屬于非角化癌，對電離輻射敏感性較高，因此臨床上多通過放射治療進行鼻咽癌的治療[1]。放射治療中通過射線造成DNA分子的斷裂、交聯，直接損傷癌細胞的DNA，同時通過引發瘤體內水分子電離的方式產生對癌細胞DNA分子造成損傷的自由基[2]。鼻咽癌具備輻射劑量依賴型，放射劑量的提高在增加腫瘤局部控制率的同時，也會導致患者出現腦神經麻痹、顳葉壞死等問題，降低患者生存率，因此提高癌細胞放射敏感性是有效控制鼻咽癌的重點內容[3-4]。有學者發現，敲除生殖器形成抑制基因-1(suppressor with morphogenetic effect on genitalia-1，SMG-1)后，癌細胞放射敏感性提高[5]。因此本研究探討了shRNA靶向干擾SMG-1表達對鼻咽癌細胞放射敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1實驗細胞與動物

穩定轉染shRNA-SMG-1有效干擾序列的人源性鼻咽癌CNE-2細胞(西南醫科大學)，轉染SMG-1無效干擾序列的人源性鼻咽癌CNE-2細胞(西南醫科大學)，野生型人源性鼻咽癌CNE-2細胞(南方醫科大學)。24只3～4周齡的雌性BALB/c-nu小鼠(成都達碩實驗動物有限公司)，于無特定病原體(SPF)級實驗動物房內分籠飼養。實驗過程嚴格遵守動物倫理委員會相關規定。

1.1.2儀器與試劑

胎牛血清(FBS)、RPMI改良培養基(美國HyClone公司)；100×青霉素-鏈霉素溶液、胰酶細胞消化液(上海碧云天生物技術有限公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)干粉、二甲基亞砜(DMSO)、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；細胞凋亡原位檢測試劑盒(瑞士Roche公司)。游標卡尺(瑞典醫科達公司)；液氮罐、高速離心機、石蠟切片機(四川海盛杰低溫科技有限公司)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；高壓滅菌鍋、恒溫水浴箱(美國PolyScience公司)；流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特公司)。

1.2 方法

1.2.1實驗分組

將實驗裸鼠隨機分為A組(未放射)、B組(放射)，隨后根據接種細胞的不同，將A、B組裸鼠再分別劃分為接種穩定轉染shRNA-SMG-1有效干擾序列的N-CNE-2SH組、Y-CNE-2SH組，接種轉染SMG-1無效干擾序列的N-CNE-2MG組、Y-CNE-2MG組，未經任何處理的野生型鼻咽癌CNE-2細胞的N-CNE-2組、Y-CNE-2組，每組4只。

1.2.2主要溶液配制

pH 7.2～7.4的PBS：于PBS干粉中加雙蒸水定容至2 000 mL，分裝，滅菌，冷卻后4 ℃密封保存。完全培養基：5.0 mL FBS混合0.5 mL青霉素-鏈霉素溶液，再加入RPMI改良培養基至50.0 mL。凍存液：1.0 mL DMSO中加FBS至10.0 mL，4 ℃預冷保存。

1.2.3人源性鼻咽癌CNE-2細胞處理

37 ℃恒溫水浴箱解凍60 s，融化后轉移至離心管低速離心(1 000 r/min離心3 min)，棄上清液，加入完全培養基，重懸為單個細胞，接種于培養皿，置于孵箱常溫培養(37 ℃、5% CO2)。細胞貼壁生長匯合度達到70%～80%時，棄舊培養基，PBS洗滌2次，加入胰蛋白酶進行消化，半數細胞懸浮時，加入完全培養基終止消化；收集細胞懸浮液，離心管低速離心(1 000 r/min離心3 min)，棄上清液，加完全培養基，一部分重懸傳代，一部分加入4 ℃預冷凍存液凍存。凍存管密封，依次按4 ℃ 30 min、-20 ℃ 1 h、-80 ℃過夜處理后，移入液氮罐中。按傳代法收集細胞后，加入完全培養基，制成細胞懸液，滴入消毒后的血球計數板中，按“計上不計下，計左不計右，2個及以上粘連細胞團計為1個細胞”的原則進行細胞計數。

1.2.4裸鼠皮下移植瘤模型建立

分別收集處于指數生長期的CNE-2SH細胞、CNE-2MG細胞、CNE-2細胞，PBS洗滌2次，細胞計數后分成2份，一份加入PBS制成濃度為1×107/mL的3種接種液；一份直接接受不同劑量的輻射照射。對裸鼠左右后側大腿處皮膚消毒后，將CNE-2SH細胞分別接種于N-CNE-2SH組、Y-CNE-2SH組；CNE-2MG細胞分別接種于N-CNE-2MG組、Y-CNE-2MG組；CNE-2細胞分別接種于N-CNE-2組、Y-CNE-2組。接種后第22天Y-CNE-2SH組、Y-CNE-2MG組、Y-CNE-2組采用局部放射治療，皮源距100 cm，輻射劑量2 Gy/次，劑量率200 cCy/min，治療頻率每天1次，連續5 d。

1.2.5蘇木素-伊紅(HE)染色

細胞接種后第40天處死全部裸鼠，剝離移植瘤，移植瘤稱質量后，進行石蠟包埋，通過HE染色觀察移植瘤組織學特點。HE染色中，首先將剝離后的移植瘤切片放置烤箱中以67 ℃烘烤2 h，烘烤后進行二甲苯脫蠟處理，并進行梯度乙醇水合，不同濃度乙醇各處理5 min。然后自來水沖洗病理切片，使用蘇木素染液染色，10 min后自來水將多余的染液沖洗，再利用1%鹽酸乙醇褪色操作，自來水將其沖洗至藍色，使用伊紅染色1 min。最后采用梯度乙醇脫水，各濃度乙醇脫水5 min，后使用二甲苯處理病理切片，中性橡膠封片，將其置于顯微鏡下觀察移植瘤組織學特點。

1.2.6末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記(TUNEL)法

以TUNEL法進行凋亡細胞的原位檢測，細胞核染成棕色的細胞即為凋亡細胞。置于顯微鏡下觀察，隨機選擇5個高倍鏡視野，并進行凋亡細胞的計數，取平均凋亡細胞數描述瘤體組織中癌細胞的凋亡情況。

1.2.7四甲基偶氮唑藍(MTT)

將處于指數生長期的CNE-2SH細胞、CNE-2MG細胞、CNE-2細胞分別接種到96孔板中(5×103個/孔)。孵育過夜后，用不同的放射劑量(0、2、4、6、8 Gy)照射細胞，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養。處理細胞48 h后，向96孔板的每個孔中加入10 μL MTT溶液(0.5 mg/mL)。孵育4 h后，倒掉每孔的上清液，并加入100 μL DMSO溶液。最后用微孔板分光光度計檢測490 nm處的吸光度。

1.2.8流式細胞術檢測細胞凋亡情況

將CNE-2SH細胞、CNE-2MG細胞、CNE-2細胞接種至6孔板中，過夜孵育后，對各組細胞進行放射處理(輻射劑量2 Gy/次，劑量率200 cCy/min)。收集細胞用0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗滌2次。加入100 μL結合緩沖液制備成懸浮液(1×106個/mL)。將懸液與Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)結合緩沖液中在室溫下避光孵育15 min。使用流式細胞儀檢測細胞凋亡,實驗重復3次。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 裸鼠移植瘤體積變化

6組裸鼠均形成可持續生長的結節，成瘤率100%。與N-CNE-2組、N-CNE-2MG組比較，N-CNE-2SH組裸鼠移植瘤的瘤體體積減小(t=15.633，P<0.05；t=11.938，P<0.01)；N-CNE-2組與N-CNE-2MG組瘤體體積比較，差異無統計學意義(t=1.324，P=0.243)。N-CNE-2SH組的體積抑瘤率為38.60%。放射后，與Y-CNE-2組、Y-CNE-2MG組比較，Y-CNE-2SH組裸鼠移植瘤的瘤體體積減小(t=16.621，P<0.05；t=17.921，P<0.05)；Y-CNE-2組與Y-CNE-2MG組瘤體體積比較差異無統計學意義(t=1.670，P=0.156)。Y-CNE-2SH組的體積抑瘤率為64.88%。與放射前比較，放射后3組裸鼠的瘤體體積均明顯減小(P<0.05)。

2.2 裸鼠移植瘤重量變化

N-CNE-2SH組的瘤體重量明顯小于N-CNE-2組、N-CNE-2MG組的瘤體重量(F=5.180，P<0.05)，質量抑瘤率為50.70%。Y-CNE-2SH組的瘤體重量明顯小于Y-CNE-2組、Y-CNE-2MG組(F=5.429，P<0.05)，質量抑瘤率為70.65%，見圖1、2。Y-CNE-2SH組瘤體重量小于N-CNE-2SH組(P<0.05)。

圖1 細胞接種第40天放射各組裸鼠情況

2.3 裸鼠移植瘤HE染色結果

N-CNE-2組、N-CNE-2MG組中裸鼠瘤體組織切片中癌細胞排列緊湊，細胞核偏大，染色較深，并未出現分辨性強的壞死區域；而N-CNE-2SH組裸鼠瘤體組織切片中出現明顯灶狀壞死區，該區域內存在癌細胞核固縮、破裂現象，且細胞質紅染區域增大。Y-CNE-2組、Y-CNE-2MG組裸鼠瘤體組織切片中出現局灶狀壞死區，部分區域出現癌細胞核固縮、破裂，細胞質紅染區域增大等現象。相比于其他5組，Y-CNE-2-SH組中裸鼠瘤體組織切片內出現大片液化壞死區，處于該區域內的癌細胞核發生固縮、破裂、溶解，且伴隨著細胞質出現大片紅染區域，見圖3。

圖2 各組裸鼠移植瘤重量變化

圖3 各組裸鼠移植瘤HE染色結果

2.4 裸鼠移植瘤內癌細胞凋亡情況

接種相同癌細胞的前提下，與A組各亞組細胞比較，B組對應各亞組癌細胞凋亡細胞數均呈明顯的增加，差異有統計學意義(P<0.05)。N-CNE-2SH組裸鼠癌細胞凋亡細胞數明顯多于N-CNE-2組與N-CNE-2MG組(t=3.867、3.557，P=0.031、0.038)。Y-CNE-2SH組裸鼠癌細胞凋亡細胞數明顯多于Y-CNE-2組、Y-CNE-2MG組(t=6.223、5.657，P=0.002、0.005)，見圖4、5。

圖4 各組癌細胞凋亡情況(TUNEL，×400)

2.5 放射各組細胞存活情況

Y-CNE-2組細胞凋亡率為3.5%，明顯低于Y-CNE-2MG組的8.0%和Y-CNE-2SH組的12.1%，差異有統計學意義(P<0.05),見圖6。

不同劑量輻射下，放射各組存活分數均隨著輻射劑量的增大而逐漸降低。Y-CNE-2SH組細胞的存活分數明顯少于Y-CNE-2MG組與Y-CNE-2組。隨著輻射劑量的增加，Y-CNE-2SH組細胞存活分數下降幅度多于Y-CNE-2MG組與Y-CNE-2組，見圖7。

圖5 各組裸鼠癌細胞凋亡情況

圖6 放射各組流式細胞圖

圖7 MTT法檢測不同放射劑量的放射各組細胞存活曲線

3 討 論

2018年，全球鼻咽癌發病12.9萬例，占全球癌癥總發病率的0.7%，我國95%以上鼻咽癌屬于非角化癌，對電離輻射具有高度敏感特性[6]。鼻咽癌屬于一種劑量依賴型腫瘤，放射劑量的提高對腫瘤局部控制十分有利，但由此易引發患者出現腦神經麻痹、吞咽困難等問題，嚴重影響患者的生存質量[7]。因此提高鼻咽癌細胞放射敏感性成為控制鼻咽癌的有效手段。射線可通過直接損傷腫瘤細胞DNA進行抗癌治療，同時放射線還可通過促使瘤體內水分子電離生成自由基，間接作用于DNA分子損傷癌細胞DNA[8-9]。SMG-1為哺乳動物體內PIKK家族成員之一，參與無義介導的mRNA降解(non-sense mRNA decay，NMD)途徑，通過該途徑降解無義突變產生的含有提前終止密碼子的mRNA，防止潛在毒性蛋白的生成[10-11]。相關文獻表明，SMG-1參與調控細胞的生長、增殖，且SMG-1基因敲除后，腫瘤細胞的放射敏感性明顯提高[12]。

有研究認為通過siRNA技術下調SMG-1表達，可在一定程度上提高癌細胞對放射的敏感度，達到改善患者預后的目的[13]。本研究通過移植瘤瘤體的體積與重量兩個指標監測裸鼠移植瘤生長情況，Y-CNE-2SH組裸鼠移植瘤瘤體體積減小幅度大于Y-CNE-2MG組、Y-CNE-2組，Y-CNE-2SH組的體積抑瘤率為64.88%。N-CNE-2SH組的移植瘤瘤體重量明顯小于N-CNE-2組、N-CNE-2MG組，重量抑瘤率為50.70%；Y-CNE-2SH組的瘤體重量明顯小于Y-CNE-2組、Y-CNE-2MG組，重量抑瘤率為70.65%；Y-CNE-2MG組瘤體重量明顯小于N-CNE-2SH組。說明接種CNE-2SH細胞的裸鼠移植瘤細胞的放射敏感性強于接種CNE-2MG細胞、CNE-2細胞的放射敏感性。

根據已有文獻可知，顯微鏡下鼻咽癌癌細胞分布呈巢狀、排列紊亂，細胞大小、形態不同，細胞核體積大，且存在核分裂不一現象，細胞異型性明顯等組織學特點[14-15]。HE染色結果顯示N-CNE-2組、N-CNE-2MG組中癌細胞排列緊湊，并未出現分辨性強的壞死區域；N-CNE-2SH組中癌細胞核固縮、破裂，有明顯灶狀壞死區。Y-CNE-2組、Y-CNE-2MG組部分區域出現癌細胞核固縮、破裂，有局灶狀壞死區出現；Y-CNE-2SH組中出現大片液化壞死區，癌細胞核發生固縮、破裂、溶解，細胞質出現大片紅染區域。從凋亡細胞數上分析，B組各亞組的癌細胞凋亡數高于A組對應亞組；Y-CNE-2SH組癌細胞凋亡數多于Y-CNE-2組、Y-CNE-2MG組；N-CNE-2SH組癌細胞凋亡數多于N-CNE-2組、N-CNE-2MG組。流式細胞儀檢測結果顯示同一劑量輻射下，Y-CNE-2SH組(12.1%)細胞的凋亡率明顯高于Y-CNE-2組(3.5%)、Y-CNE-2MG組(8.0%)。結合文獻可知，shRNA靶向干擾SMG-1表達有利于鼻咽癌癌細胞的控制，同時通過促進瘤體細胞凋亡的方式提高癌細胞放射敏感性。

綜上所述，shRNA靶向干擾SMG-1表達可在一定程度上抑制鼻咽癌CNE-2細胞瘤體的生長，提高瘤體細胞凋亡率；shRNA靶向干擾SMG-1表達聯合放療對瘤體生長抑制作用更為明顯，同時具備更有效的促癌細胞凋亡作用，即shRNA靶向干擾SMG-1表達可提高鼻咽癌細胞放射敏感性。