解痙多肽表達化生動物模型的研究進展*

陳萬群，張金衛，羅 楊 綜述，楊小軍△ 審校

(重慶市中醫院：1.消化科；2.皮膚美容科 400021)

胃腺癌作為世界范圍內高致死率的腫瘤之一，其中幽門螺桿菌(helicobacter pylori,Hp)感染被認為是其發生、發展最重要的危險因素[1]。持續的感染及慢性炎癥導致胃癌前病變患者出現泌酸腺體缺失，即形成慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)[2]。CAG表現為胃單位的重組，即以峽部胃單位(胃小凹和深部胃竇細胞之間)胃祖細胞的增殖，以及胃腺體基底部有絲分裂后的主細胞重組成為增殖的化生細胞[3]。胃單位重組形成慢性萎縮被稱為解痙多肽表達化生(spasmolytic polypeptide-expressing metaplasia,SPEM)[4]，這種化生形式具有進化保守性，可導致近端胃單位(如胃竇)的短暫性改變，進而使得其在應對深部腺體損傷條件下，具有修復及重組為正常胃黏膜結構的功能[5]。但是在某些條件下，重組被中斷后持續的SPEM可以進展到異型增生[6]。

既往動物研究證實腸化生(intestinal metaplasia,IM)起源于SPEM，其中某些研究發現造模方式不同也會導致SPEM的進展不同，如Hp感染所致的SPEM僅進展到異型增生，而不會進展至IM，但這些研究均證實SPEM為癌前級聯反應的初始步驟[3,6-8]。目前國內胃癌前病變動物模型研究鮮有涉及SPEM，本文就SPEM動物模型做一綜述。

1 DMP-777誘導的缺乏炎癥的SPEM模型

為了構建泌酸腺體萎縮模型，在2000年，GOLDENRING等[9]開展了DMP-777 誘導的可逆性泌酸腺體萎縮的研究，即單獨以該試劑處理小鼠特定時間后胃黏膜可自行恢復。DMP-777是一種具有選擇性的人白細胞彈性蛋白酶抑制劑，通常以濃度2%懸浮在0.5%的甲基纖維素的溶液中。研究證實DMP-777可導致特定壁細胞缺失，胃小凹增生而致使正常腺體細胞系缺乏。

有研究發現DMP-777處理小鼠在2 d內即可導致壁細胞的快速缺失，予野生型小鼠連續灌胃7 d，在腺體基底部即可出現表達解痙多肽(Trefoil factor 2，TFF2)的黏膜細胞系化生——SPEM；而在敲除胃泌素小鼠中，灌胃1 d即可形成在蛋白及核酸水平均陽性表達TFF2的SPEM；經DMP-777處理14 d后，敲除胃泌素小鼠繼續予以戒斷DMP-777為期14 d的觀察，SPEM仍持續存在，故可得出SPEM形成依賴于胃泌素[10]。該團隊后續又對上皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)是否調節泌酸腺體萎縮的化生應答進行了相關研究，分別予敲除雙調蛋白、轉化生長因子α及其野生型小鼠DMP-777灌胃，灌胃時間及藥物恢復期均為14 d，結果發現敲除雙調蛋白可促進泌酸腺體萎縮，SPEM及IM的形成[8,11-12]。因DMP-777誘導SPEM具有自身特點，仍在近期研究中與其他幾種造模方式形成模型對照，以研究主細胞化生機制[13]。

2 Hp或貓螺桿菌(H.felis)感染小鼠形成慢性炎癥的動物模型

Hp感染引起慢性淺表性胃炎并可進展至慢性萎縮性胃炎、腸化、異型增生甚至胃癌，現有研究主要通過Hp或H.felis注射、灌胃或者與黏膜共培養形成相關模型。研究證實H.felis可加速C57BL/6小鼠胃黏膜萎縮、細胞凋亡及改變細胞系分化[14-15]。抑酸及Hp感染均可導致高胃泌素血癥，有研究發現胰島素-胃泌素轉基因小鼠在20月齡時表現為胃黏膜化生、異型增生、原位癌及具有血管浸潤的胃癌，而H.felis感染的胰島素-胃泌素轉基因小鼠可進一步加速黏膜內腫瘤的發生(85%)，黏膜下腫瘤浸潤(54%)及血管內浸潤(46%)，說明H.felis感染對化生、異型增生及腫瘤形成具有重要作用[16]。

此后，又有研究縮膽囊素/胃泌素受體及組胺H2受體信號通路在胃黏膜萎縮和胃癌中的作用，證實縮膽囊素/胃泌素及組胺H2受體拮抗劑具有協同抑制H.felis感染的胰島素-胃泌素轉基因小鼠模型胃黏膜萎縮和胃癌形成的作用[17]。另有研究發現Hp感染早期即形成SPEM，腺體改變起源于持續感染Hp的SPEM腺體中，即由SPEM繼發IM[7]。同樣，使用H.felis感染C57BL/6小鼠6個月可形成SPEM模型，證實SPEM為癌前初始步驟，SPEM為進展至異型增生乃至胃癌的關鍵階段[18]。因Hp或H.felis感染所致的SPEM模型基本可模擬人體的SPEM形成過程，故與人體臨床標本對照可用于研究SPEM腺體細胞的遺傳不穩定性[19]。

3 L-635形成快速誘導的具有炎癥應答的SPEM小鼠模型

由于DMP-777可抑制中性粒細胞彈性蛋白酶，在早期固有免疫應答階段阻止炎癥應答，因此DMP-777形成的壁細胞缺失的SPEM模型缺乏炎癥應答。而人體內化生的形成均在一系列炎性反應的條件下產生，為了形成具有炎癥的新型的壁細胞缺失的SPEM模型，有研究者用德國默克公司合成的結構性相關的β內酰胺復合物，該復合物可以保持壁細胞質子載體潛在的活性，但卻不會攻擊中性粒細胞彈性蛋白酶。予C57BL/6小鼠連續灌胃3 d后，TFF2、內因子均陽性表達的SPEM模型快速形成，這一模型再次證實炎癥和壁細胞缺失共同構成SPEM。

在前期研究基礎上，研究者比較了DMP-777、L-635及H.felis誘導的SPEM模型，結果發現，3種不同的造模方式均可形成SPEM，至少是主細胞的部分轉化，L-635造模的特點為快速形成具有炎癥應答的主細胞轉化的SPEM模型[3]，缺點是合成L-635價格昂貴，不易獲得，在一般實驗室難以得到推廣。使用前面所述的3種造模方式，研究發現凝集素(clusterin)在3種不同方式造模小鼠中均異常升高，而囊性纖維化跨膜傳導調節蛋白(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)僅在具有炎癥表達的模型中表達升高，在人胃黏膜中，CFTR在腸化組織而非SPEM中表達[20]。由于L-635與DMP-777形成的SPEM存在炎癥有無的差別，故研究炎癥細胞通路在SPEM生成的作用可利用此兩種不同的造模方式，作為良好的對比模型，IL-33/13細胞因子信號通路在化生中的作用得到證實[21]。此后，基于該信號通路，后續研究發現外源性給予IL-33可使正常小鼠誘導SPEM形成[22]。由此看出，隨著SPEM形成機制的深入研究，未來SPEM構建模型將出現多樣化趨勢。

4 Tamoxifen誘導的急性SPEM小鼠模型

由于DMP-777所致SPEM模型缺乏炎癥應答，L-635價格昂貴而不易獲得，H.felis誘導的SPEM造模時間長且可能伴有異型增生乃至胃癌，故探索新型的造模劑極為迫切。Tamoxifen是一種廣泛使用于臨床與研究的選擇性雌激素受體調節劑，研究發現予Tamoxifen≥3 mg/20 g正常小鼠體重3 d，即可導致超過90%胃壁細胞凋亡及酶原主細胞化生，且胃組織可在3周后恢復正常[23]。這一造模方式成為目前研究SPEM最常用的造模方式，并形成了相關方法學文獻指導，使得這一造模方式具有均一、可重復驗證而得以推廣[24]。

鑒于Tamoxifen造模的穩定性，借助此模型開展了對SPEM相關炎性因子如白細胞介素-10(IL-10)的研究[25]，急性藥物及慢性炎癥所致胃黏膜損害所致SPEM的單細胞轉錄分析[26]。構建此項模型后，同樣也為研究Hp與化生改變之間的關系創造了良好條件，將Tamoxifen誘導的急性SPEM小鼠胃黏膜形成自由浮動的組織塊，與Hp共培養后證實，不管在人還是小鼠SPEM腺體中，均可通過路易斯抗原(sialyl-Lewis X，sLex)連接[27]。同時，為了研究頸黏液細胞、主細胞及SPEM細胞在小鼠中增殖和分化模式，最新研究在使用Tamoxifen及Hp誘導形成胃黏膜損害的同時，予以溴尿苷作為誘變劑進行干預，進一步對穩態或化生誘導的胃黏膜損害的細胞增殖和分化進行了研究報道[28]。以SPEM為代表的各類化生究竟如何增加致癌的風險，為了研究這一問題，有研究者將C57BL/6小鼠共同飼以高劑量Tamoxifen及雷帕霉素，在誘導SPEM同時可阻滯哺乳動物雷帕霉素靶蛋白敏感型復合體(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)活性，并讓小鼠自由飲用含亞硝基脲的水誘導胃癌形成[29]。

隨著對SPEM機制研究的深入，近期研究傾向于將多種模型對比使用或聯合使用，或聯合使用關鍵基因、蛋白敲除小鼠等復合形成動物模型，或加用其他化學藥物，以達到驗證既定研究假設的作用[29-31]。如使用DMP-777、L-635、H.felis之間形成不同對照模型，研究主細胞轉化的機制[32]。或者為了研究特定蛋白對SPEM的影響，使用敲除該蛋白如人附睪蛋白4(human epididymis protein 4,HE4)基礎上，分別使用DMP-777、L-635、高劑量Tamoxifen誘導的SPEM模型，以研究HE4蛋白在胃癌形成中的作用[33]。

5 脫氧膽酸(deoxycholic acid，DCA)刺激巨噬細胞源外泌體促進SPEM形成

DCA作為一種對人類有害的次級膽汁酸，有研究證實其可促進腸化生標記物的表達。基于此，有研究者將6周齡大的C57BL/6雄性小鼠隨機分成正常對照組(無菌水灌胃)、DCA組(100 μmol/L DCA溶于無菌水中)，兩組中每只小鼠每天用200 μL無菌水灌胃(含或不含DCA)，4周后收獲胃黏膜標本，熒光免疫檢測SPEM標記物TFF2、GSⅡ外源凝集素，結果顯示此種造模方式同樣可形成SPEM[34]。但此種造模方式目前僅有一個研究采用，其穩定性尚待更多研究予以證實。

6 總 結

綜上所述，不管藥物誘導還是Hp或H.felis感染均可形成SPEM模型，但因不同藥物及Hp或H.feli感染的不同特性，使得誘導模型具有自身特點，均可為目前研究SPEM生成及進展機制使用。研究者可根據研究目的選擇相應造模方式，同時由于各個模型的自身局限性，開展不同模型進行對照研究可以較好揭示SPEM在胃癌前病變中的作用機制。