tst?1基因在兒童金黃色葡萄球菌肺炎感染中的臨床應用價值

褚敏君 李新月 麻明彪 李玨 王海平 杜廷義★

金黃色葡萄球菌肺炎（staphylococcus aureuspneumonia，SAP）是目前兒童和嬰幼兒期病死率較高的一種嚴重性疾病，早期識別兒童重癥SAP 并及時采取干預措施，對提高救治成功率非常關鍵。中毒性休克綜合征毒素（toxic shock syndrome toxin?1，TSST?1）是一種金黃色葡萄球菌特有的外毒素，由毒力基因tst?1編碼合成。該毒素具有很強的超抗原活性，可引發機體炎癥因子風暴，導致機體炎癥失控和多器官損害。此外，TSST?1 還可直接損傷肝臟枯否細胞，使內毒素在體內大量蓄積，引發毒性休克綜合征，加重感染程度。有研究提示tst?1基因的攜帶與金黃色葡萄球菌的致病性密切相關，該基因的存在可能反映患者的病情進展［1］。國內外研究發現，tst?1陽性菌株主要分離自呼吸道感染、菌血癥和腹腔感染病例［2?4］，而檢出科室主要集中在ICU，感染較重。本實驗室近期完成的實驗研究也發現tst?1基因在重癥肺炎患兒中擁有極高的檢出率，并且該基因的攜帶可進一步加重患兒病情［5］。由此產生了tst?1基因檢測對于兒童SAP 重癥化趨勢是否具有預判價值的科學問題；并對此問題進行了初步的實驗研究，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2018年11月至2020年12月昆明市兒童醫院經臨床診斷和病原學檢測確診為金黃色葡萄球菌性肺炎的196 例住院患兒。其中輕癥肺炎142 例，重癥肺炎54 例。輕重癥肺炎患兒均以男性為主，年齡均主要分布在1月齡～1 歲，輕癥肺炎患兒年齡中位數為2月，重癥肺炎患兒年齡中位數為1月。輕重癥肺炎組間性別、年齡比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。見表1。納入標準：①28 天<患兒年齡≤14 歲，性別不限；②臨床相關檢查指標（包括血常規、CRP、PCT 或影像學檢查）和病原學檢測支持確診為SAP 患兒；③患兒臨床資料完整。排除標準：①肺部手術史、肺栓塞、肺水腫、肺結核等肺部疾??；②免疫抑制、粒細胞減少癥以及肝腎功能嚴重異常；③發育不良或嚴重營養不良；④惡性腫瘤、多發性感染；⑤中途轉院或資料缺失。本研究經院倫理委員會批準，受試患兒家屬均簽署知情同意書。

表1 肺炎患兒一般情況比較Table 1 Comparison of general conditions of children with pneumonia

1.2 肺炎嚴重程度分組

通過醫院His 系統查閱肺炎患兒整個住院過程中的臨床數據，觀察患兒住院期間的進展情況，根據中華人民共和國國家衛生健康委員會2019年制定的標準［6］對肺炎患兒進行評估，分為輕癥肺炎組和重癥肺炎組。

1.3 樣本含量估算

采用病例對照研究樣本含量相關公式進行估算：根據前期研究［5］，tst?1基因在重癥SAP 中檢出率為72%，代入病例組估計暴露率，預估tst?1基因在輕癥SAP 中檢出率為20%，代入對照組估計暴露率，檢驗水準α 取0.05，檢驗效能1?β 取0.8，計算得重癥SAP 組和輕癥SAP 組至少各需樣本量20 例，本次研究總樣本量應大于等于40 例。

1.4 實驗菌株

收集納入研究患兒的深部痰液、肺泡灌洗液分離培養得到的SA 菌株。納入標準：①采集標本需合格（判斷標準：鱗狀上皮細胞<10/LP，白細胞>25/LP 或鱗狀上皮細胞：白細胞<1∶2.5）。②所有菌株經菌落形態觀察、革蘭染色鏡檢以及VITEK?2 Compact 全自動微生物分析儀進行鑒定。③剔除同一病例的重復菌株。

1.5 主要儀器及試劑

VITEK?2 Compac 全自動微生物分析儀（法國生物梅里埃公司），ABI 7300 熒光定量PCR 儀（美國賽默飛世爾科技公司），細菌基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司），TB Green?Premix Ex Taq?II 試劑盒（大連寶生物工程有限公司），PCR 引物由北京擎科生物科技有限公司昆明分公司合成。

1.6 實驗方法

1.6.1 細菌DNA 模板制備

使用TaKaRa 公司提供的細菌基因組DNA 提取試劑盒并嚴格按照說明書進行提取。

1.6.2tst?1基因引物

tst?1基因引物序列見表2。

表2 tst?1 基因引物序列Table 2 Primer sequence of tst?1 gene

1.6.3 實時熒光定量PCR 反應體系及反應條件

使用實時熒光定量PCR 檢測tst?1基因，反應體系總體積為20 μL，其中SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）10 μL，10 μΜ Forward/Reverse Primer 各0.8 μL，細菌DNA 模板2 μL，ROX 染料0.4 μL，RNase?free water 6 μL。反應體系配制及加樣操作均在冰上進行。PCR 擴增反應條件：94℃5 min，30×（94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min），72℃10 min，陽性樣本在擴增反應圖譜中呈現S 型曲線。

1.6.4 質量控制

在檢測過程中加入陽性對照（ATCC43300）和陰性對照（ATCC29213）。擴增結束后增加熔解曲線測定以驗證引物特異性，排除非特異性擴增。

1.7 統計學方法

采用SPSS 25 軟件進行數據統計分析；計數資料以n（%）表示，行χ2檢驗；年齡為非正態分布計量資料，以中位數和四分位數間距表示，比較采用非參數U 檢驗；繪制ROC 曲線分析tst?1基因對兒童重癥SAP 的診斷價值。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 tst?1 基因檢測結果在肺炎患兒中的分布

在196 株金黃色葡萄球菌中，共檢出tst?1基因陽性菌株24 株，檢出率為12.24%。其中，輕癥肺炎中共檢出7 株（7/142），檢出率為4.93%，重癥肺炎中共檢出17 株（17/54），檢出率為31.48%。重癥肺炎中tst?1基因的檢出率高于輕癥肺炎，差異有統計學意義（χ2=25.668，P<0.05）。見表3。

表3 tst?1 基因在肺炎患兒中的分布［n（%）］Table 3 the distribution of tst?1 gene in children with pneumonia［n（%）］

2.2 tst?1 基因對兒童重癥SAP 的診斷試驗評價

tst?1基因對兒童重癥SAP 診斷的靈敏度為0.315（95%CI：0.199～0.457），特異度為0.951（95%CI：0.897～0.978），陽性預測值為0.708（95%CI：0.488～0.866），陰性預測值為0.785（95%CI：0.714～0.842），曲線下面積為0.633。見圖1。

圖1 ROC 曲線Figure 1 ROC curve

3 討論

肺炎是兒童時期的常見病和多發病，SAP 是兒童感染常見的細菌性肺炎之一。在本研究中，SAP 感染主要分布在1月齡～1 歲，其占比超過了70%，提示SAP 主要以嬰幼兒為主，具有幼齡化的特征，與文獻報道一致［7?8］。由于患兒年齡小且金黃色葡萄球菌致病力強，感染后病情進展迅速，如不及時治療，極易引起膿毒血癥、毒性休克綜合征等一系列嚴重并發癥，病死率較高。因此，早期識別兒童重癥SAP，對提高救治成功率非常關鍵。

目前重癥肺炎的識別主要從反映呼吸系統或全身炎癥反應嚴重程度的臨床表現來判斷［9］，某些生化指標雖被認為與肺炎的嚴重程度或預后有一定的相關性［10］，但都不能明確診斷或判斷重癥肺炎的預后，且無論是臨床表現還是生化指標，均在患兒病情加重時才會發生較大幅度變化，對于SAP 這樣病情進展迅速的疾病來說已經相對較晚，主要作為病情監測指標而非早期鑒別指標。因此，對兒童重癥SAP 的診治迫切需要新的、可靠的在早期診斷方法和指標。

感染性疾病嚴重程度主要取決于病原菌毒力與宿主免疫反應之間的關系［11］，研究毒力基因在疾病中的分布及作用可為SAP 感染嚴重程度的診斷提供新的思路。金黃色葡萄球菌毒力基因tst?1主要通過編碼合成中毒性休克綜合征毒素（TSST?1）致病。該毒素是一種金黃色葡萄球菌特有的外毒素，具有很強的超抗原活性。當金黃色葡萄球菌入侵機體時，TSST?1 通過發揮超抗原作用，引發機體炎癥因子風暴，導致機體炎癥失控和多器官損害。此外，TSST?1 還可直接損傷肝臟枯否細胞，抑制內毒素脫顆粒反應并使其在體內大量蓄積，引發毒性休克綜合征，加重感染程度。

在臨床研究方面，Koosha 等［1］研究發現，攜帶tst?1基因的金黃色葡萄球菌越多，疾病的易感性越強。段曉丹等［12］報道tst?1基因陽性臨床分離株主要來源于痰液、膿液標本，提示tst?1陽性菌株很可能引發呼吸系統及化膿方面感染。麻明彪等［5］對常見毒力基因在兒童SA 肺炎及化膿性感染中的分布與疾病臨床表現之間的關系進行研究，發現tst?1基因在重癥肺炎組中有極高檢出率，并且該基因的攜帶可加重患兒臨床病情。在本研究中，tst?1基因在呼吸道標本中的總檢出率為12.24%，與國內外近年來報道的10%～30%大致相符［13?14］，其中，重癥肺炎中tst?1基因的檢出率高于輕癥肺炎（P<0.05）。通過關聯強度分析得到OR 值為8.927，即tst?1+SA 感染兒童患重癥SAP 的危險性是tst?1?SA 感染兒童患重癥SAP 危險性的8.927 倍，且95%CI下限大于1，提示tst?1基因陽性與重癥SAP 呈正相關關系，攜帶有tst?1基因的菌株是導致兒童重癥SAP 肺炎發生的危險因素，該基因的檢測對臨床兒童重癥SAP 的診斷和病情預判具有潛在價值。

進一步的診斷效能評價顯示，tst?1基因對重癥SAP 的診斷有較高特異度（0.951），但靈敏度（0.315）相對較低，并且受靈敏度較低的影響，ROC曲線下面積僅為0.633。如果要對重癥SAP 進行早期預判和篩檢，及時進行干預，所選取的指標需要較高的靈敏度，因此tst?1基因作為重癥SAP 的早期篩檢指標還存在不足。

作為一種感染性疾病，肺炎的發生及病情進展受人群、菌株、社區或醫院環境等多種因素共同影響［15］，使用單一因素對其進行直接預判是不夠全面的。有文獻報道稱，年齡、早產、先天性心臟病、伴隨貧血、多重耐藥菌感染、生活環境差以及季節均是重癥肺炎發病危險因素［16］，因此需要對多種因素進行聯合分析診斷以提高敏感度及特異度。在這一過程中，tst?1基因作為一個有價值的危險因素，雖然單獨的診斷價值有限，但可參與到重癥SAP 的多因素分析及風險評估模型的建立之中。

此外，本次研究是從臨床層面研究并發現tst1基因與重癥SAP 具有一定的相關性，在未來可開展細胞、動物實驗，減少干擾因素，進一步驗證tst?1+SA 與肺炎重癥化的關系。

綜上所述，tst?1+SA 是導致重癥SAP 發生的重要危險因素，對于重癥SAP 的預測具有潛在的應用價值，但存在不足。對其在臨床鑒別診斷，病情預判方面的應用研究，應結合其它危險因素進行深入廣泛的研究和探討。