芳基烴受體AhR對CVB3誘導病毒性心肌炎小鼠心肌細胞損傷和焦亡的影響

紀新博， 顧申紅， 麥華德， 符碧薇

(1.海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院全科醫(yī)學科, 海南 ?？?570100 2.海南醫(yī)學院基礎醫(yī)學與生命科學學院, 海南 海口 571199)

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是一種由病毒感染及相關自身免疫性疾病引起的非缺血性炎癥性疾病，以心肌非特異性間質(zhì)性炎癥為主要病變，占心肌炎的絕大多數(shù)，也是引起年輕人心力衰竭、心律失常和猝死的重要原因[1]。流行病學研究表明，VMC的發(fā)病率每年約達到1.0～2.2百萬[2]。VMC通常表現(xiàn)為胸痛、心悸、呼吸困難，部分患者可能發(fā)展為心力衰竭，給患者和社會均帶來巨大的經(jīng)濟負擔。目前，抗病毒藥物、免疫抑制劑和循環(huán)支持是VMC的主要治療方法，但仍有許多患者在治療后發(fā)展為心力衰竭[3]。因此，探索VMC的發(fā)病機制及其新型有效治療方法仍是十分必要的。芳基烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AhR)是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，該基因位于人類7p21染色體上，在人體肺、腎、肝和胸腺等各器官組織中均表達。AhR在與配體如多環(huán)和鹵代芳烴及其他外源性物質(zhì)相互作用后，以異二聚體形式與AHR核轉(zhuǎn)運蛋白結合，成為介導外源代謝和環(huán)境反應的多功能蛋白質(zhì)，在氧化應激、炎癥反應、細胞生長及轉(zhuǎn)移等方面均表現(xiàn)出不同的生物學作用，并參與調(diào)控先天性和適應性免疫反應[4,5]。但關于AhR在VMC中的功能及作用研究報道相對較少，鑒于此，本研究通過柯薩奇B3病(coxsackievirus 3，CVB3)誘導構建VMC小鼠模型，并給予AhR抑制劑CH223191進行干預，旨在探討抑制AhR對VMC中心肌損傷的影響及其作用機制，從而為該疾病的臨床治療研究提供實驗依據(jù)與理論基礎。

1 材料與方法

1.1實驗動物:60只健康BALB/c小鼠(購于海南藥物研究所有限責任公司)，雄性，6周齡，體質(zhì)量20～22g，飼養(yǎng)于海南醫(yī)學院實驗動物中心，溫度設置為22～24℃，相對濕度為65%，并以12h/12h明暗周期交替。實驗期間，所有小鼠均自由飲水與飲食。

1.2主要試劑與材料:AhR抑制劑CH223191購于美國Selleckchem公司，CVB3購于美國標準菌種保存中心，cTnl、TNF-α、IL-1β及IL-18 ELISA檢測試劑盒購于南京凱基生物公司，HE染色試劑盒購于上海翌圣生物公司，TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購于武漢博士德生物公司，免疫組織化學染色試劑盒購于北京索萊寶生物公司，DAPI染液瑞士Roche公司，Trizol試劑盒、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒和SYBR?Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)試劑盒購于大連寶生物工程公司，DAB顯色試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白測定試劑盒、PVDF膜以及ECL試劑液均購自上海碧云天生物研究所，抗體caspase-1、ASC、NLRP3、GSDMD及GAPDH等購于英國Abcam公司。

1.3方 法

1.3.1動物分組、造模及處理:將60只BALB/c雄性小鼠按照數(shù)字隨機表法分為4組：對照組(Control)、AhR抑制劑組(AhR inhibitor)、模型組(VMC)、VMC+AhR抑制劑組(VMC+AhR inhibitor)，每組15只。模型組和VMC+AhR抑制劑組的小鼠參考文獻方法[6]，通過腹腔注射0.1 mL CVB3病毒液(滴度為107 TCID50)構建心肌炎動物模型，對照組和AhR抑制劑組的小鼠同時腹腔注射等量PBS溶液。同時，AhR抑制劑組和VMC+AhR抑制劑組(VMC+AhR inhibitor)的小鼠參考文獻[7]按照10 mg/kg的劑量分別腹腔注射AhR抑制劑CH223191，對照組和模型組的小鼠均腹腔注射等量PBS溶液，連續(xù)10d。

1.3.2心臟超聲檢測:各組小鼠給藥10d后，1.5%異氟烷吸入麻醉，固定在手術臺上，通過高分辨率Vevo2100小動物超聲成像系統(tǒng)進行心臟超聲檢測，記錄小鼠左心室射血分數(shù)(ejection fraction，EF)、縮短分數(shù)(fractional shortening，F(xiàn)S)、左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular internal diameter at end-diastole，LVIDd)以及左室舒張末期前壁厚度(left ventricular anterior wall during diastole，LVAWd)等心功能相關指標。

1.3.3ELISA法:各組小鼠通過心臟取血，將血液標本室溫靜置2h后，4℃下以4000r/min離心10min，收集上層血清，根據(jù)ELISA檢測試劑盒說明書操作，制作標準曲線，測定各組小鼠血清中cTnl、TNF-α、IL-1β和IL-18的含量。

1.3.4HE染色:收集各組小鼠心臟標本，清洗干凈，置于4%多聚甲醛中室溫固定過夜。次日，采用梯度乙醇對組織進行脫水處理，二甲苯透明，蠟塊包埋，切片機上連續(xù)切片，制備厚度約為4μm的石蠟組織切片，進行蘇木精-伊紅(HE)染色，切片脫蠟水化，蘇木素染色5min，流水沖洗干凈，伊紅染液復染3min，經(jīng)過脫水與透明處理后，中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察心肌組織病理改變并攝取圖像。

1.3.5TUNEL染色:將心肌組織石蠟切片脫蠟水化后，PBS清洗，加入100μL濃度為20μg/mL蛋白酶K工作液(不含DNase)，室溫水解15min，蒸餾水沖洗，封閉液封閉10min，取新鮮配置的50μL TUNEL檢測液滴加于切片上，37℃避光孵育1h。PBS清洗后，滴加DAPI染液，室溫避光孵育10min，含抗熒光淬滅劑封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察心肌組織細胞染色情況，并攝取圖像。TUNEL陽性凋亡細胞染色顯示為綠色，隨機選擇5個視野，計數(shù)固定視野范圍內(nèi)總細胞數(shù)目與TUNEL陽性細胞數(shù)目，兩者比值為TUNEL細胞陽性率。

1.3.6免疫組化染色檢測:將心肌組織石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，按照標準免疫組織化學進行染色。將切片置于檸檬酸鹽液浸泡，高溫下修復抗原。放入新鮮配置的3%過氧化氫溶液中，室溫孵育10min，再置于5%山羊血清中，室溫封閉30min；分別加入兔抗NLRP3多克隆抗體(1∶200)與兔抗GSDMD多克隆抗體(1∶200)，置于4℃下孵育過夜。次日，棄原液，甩干切片，加入對應二抗覆蓋切片，室溫繼續(xù)孵育1h；采用DAB試劑在室溫下顯色后，蘇木精復染5min，分化數(shù)秒，自來水沖洗干凈，經(jīng)過脫水與透明后，中性樹膠封片，光學顯微鏡下對免疫組織化學切片攝影，陽性染色呈黃棕色至棕色，Image-Pro Plus6.0軟件測定陽性染色的強度。

1.3.7實時熒光定量PCR:在無菌環(huán)境下將心肌組織剪碎，置于研缽并加入適量液氮充分研磨，取50mg研磨的粉末，利用Trizol試劑盒提取總RNA，Nano drop儀器測定RNA濃度與純度(OD260/280在1.8～2.1之間為合格)；去除gDNA后，通過反轉(zhuǎn)錄實驗合成cDNA，再以獲得的cDNA為模板，根據(jù)實時熒光定量PCR試劑盒說明書檢測擴增，定量各基因的mRNA表達水平，β-actin作為內(nèi)參基因。熒光定量PCR反應系統(tǒng)程序設置為：95℃預變性3min，1次循環(huán)；95℃變性20s，60℃退火15s，72℃延伸45s，42次循環(huán)。實驗重復3次，擴增反應結束后，以2-ΔΔCt法計算各目的基因的mRNA相對表達量。見表1。

表1 各基因引物序列

1.3.8Western blot:將心肌組織置于研缽內(nèi)，加入適量液氮充分研磨，添加新鮮配置的RIPA裂解液充分混勻，置于冰上裂解30 min，4℃下以12000 r/min離心20min，吸取上清，并以BCA法檢測蛋白濃度；制備10%SDS-PAGE，待膠凝固后，根據(jù)蛋白濃度計算上樣體積，在梳孔內(nèi)加入等量蛋白樣品，通過電泳分離蛋白，切割分離蛋白的凝膠，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜結束后，將其置于5%脫脂奶粉中，室溫封閉1h。TBST洗膜，將膜與稀釋的一抗(caspase-1、ASC、NLRP3、GSDMD，均以1∶1000進行稀釋)在4℃下共孵育過夜；次日，棄原液，TBST洗膜，加入對應稀釋的二抗，室溫孵育1h，TBST再次洗膜后，以ECL顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)拍攝蛋白條帶，Image-Pro Plus 6.0軟件分析條帶灰度值，GAPDH作為內(nèi)參蛋白，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值作為各目的蛋白的相對表達量。

2 結 果

2.1抑制AhR改善CVB3誘導的病毒性心肌炎小鼠心功能:各組小鼠心功能指標檢測結果顯示，與對照組比較，VMC組小鼠FS和EF顯著下降(P<0.05)，LVIDd和LVAWd顯著增加(P<0.05)；與VMC組比較，VMC+AhR抑制劑組小鼠FS和EF顯著升高(P<0.05)，LVIDd和LVAWd顯著減小(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組小鼠心功能指標檢測結果

2.2抑制AhR改善CVB3誘導的病毒性心肌炎小鼠心肌損傷:與對照組比較，VMC組小鼠血清中cTnl、TNF-α、IL-1β以及IL-18的含量均顯著上升(P<0.05)；與VMC組比較，VMC+AhR抑制劑組小鼠血清中cTnl、TNF-α、IL-1β以及IL-18的含量均顯著下降(P<0.05)，見表2。

表2 各組小鼠血清中cTnl TNF-α IL-1β和IL-18含量比較

2.3抑制AhR減輕CVB3誘導的病毒性心肌炎小鼠心肌組織病變:通過HE染色觀察可見，對照組和AhR抑制劑組小鼠的心肌組織結構清晰，細胞排列整齊，未見明顯的損傷現(xiàn)象；VMC組小鼠心肌組織發(fā)生明顯病變，可見組織內(nèi)細胞排列紊亂，有大量炎性細胞浸潤，部分血管滲出蛋白黏液；而相較于VMC組，VMC+AhR抑制劑組小鼠心肌組織內(nèi)炎性細胞浸潤減少，細胞排列較為整齊，病理損傷現(xiàn)象明顯減輕，見圖2。

圖2 HE染色觀察各組小鼠心肌組織病理學形態(tài)(×100)

2.4抑制AhR減少CVB3誘導的病毒性心肌炎小鼠心肌細胞凋亡:TUNEL染色檢測各組小鼠心肌組織內(nèi)心肌細胞凋亡，經(jīng)分析檢測結果發(fā)現(xiàn)，VMC組小鼠心肌組織內(nèi)染色區(qū)域明顯多于對照組，TUNEL陽性率顯著升高(P<0.05)；而VMC+AhR抑制劑組小鼠心肌組織內(nèi)染色區(qū)域明顯少于VMC組，TUNEL陽性率顯著降低(P<0.05)，見圖3。

圖3 TUNEL染色檢測各組小鼠心肌組織細胞凋亡(×100)

2.5抑制AhR抑制CVB3誘導的病毒性心肌炎小鼠心肌組織內(nèi)NLRP3和GSDMD表達:利用免疫組織化學染色檢測各組小鼠心肌組織內(nèi)NLRP3和GSDMD表達，根據(jù)染色結果分析顯示，與對照組比較，VMC組小鼠心肌組織內(nèi)NLRP3陽性表達率和GSDMD陽性表達率均顯著升高(P<0.05)；與VMC組比較，VMC+AhR抑制劑組小鼠心肌組織內(nèi)NLRP3陽性表達率和GSDMD陽性表達率均顯著降低(P<0.05)，見圖4。

圖4 免疫組織化學染色檢測各組小鼠心肌組織NLRP3和GSDMD表達(×100)

2.6抑制AhR下調(diào)CVB3誘導的病毒性心肌炎小鼠心肌組織內(nèi)焦亡相關基因/蛋白表達:qRT-PCR測定各組小鼠心肌組織內(nèi)焦亡相關基因caspase-1、ASC、NLRP3及GSDMD在mRNA上的表達水平，結果顯示，與對照組比較，VMC組小鼠心肌組織內(nèi)caspase-1、ASC、NLRP3及GSDMD的mRNA相對表達量均顯著上調(diào)(P<0.05)；與VMC組比較，VMC+AhR抑制劑組小鼠心肌組織內(nèi)caspase-1、ASC、NLRP3及GSDMD的mRNA相對表達量均顯著下調(diào)(P<0.05)，見圖5。

圖5 qRT-PCR測定各組小鼠心肌組織內(nèi)焦亡相關基因表達

Western blot檢測各組小鼠心肌組織內(nèi)焦亡相關蛋白caspase-1、ASC、NLRP3及GSDMD的表達水平，結果顯示，VMC組小鼠心肌組織內(nèi)caspase-1、ASC、NLRP3及GSDMD 的蛋白相對表達量均顯著高于對照組(P<0.05)；而相較于VMC組，VMC+AhR抑制劑組小鼠心肌組織內(nèi)caspase-1、ASC、NLRP3及GSDMD的蛋白相對表達量均顯著下調(diào)(P<0.05)，見圖6。

圖6 Western blot檢測各組小鼠心肌組織內(nèi)焦亡相關蛋白表達

3 討 論

目前，已有多種病毒被認為是引起心肌炎的病因，雖然通過心內(nèi)膜心肌活檢證明了細小病毒B19(PVB19)是心肌炎中最常見的病毒，但CVB3仍是導致人類和動物病毒性心肌炎的主要病原體，大約25～27%擴張型心肌病是由CVB3引起的。與其他多種病毒的模式相同，CVB3能夠通過對宿主造成直接損傷和宿主免疫系統(tǒng)功能異常誘導的間接損傷來引發(fā)VMC[3]。在本研究中，經(jīng)過CVB3誘導的小鼠表現(xiàn)出FS和EF下降，LVIDd和LVAWd增加，心肌組織內(nèi)炎癥細胞浸潤增多和心肌細胞壞死，由此表明CVB3小鼠模型構建成功。

VMC的主要特征是由病毒感染引起的心肌實質(zhì)或間質(zhì)的局部性或彌漫性病變。機體受到感染后，如果免疫系統(tǒng)無法消除病毒，可觸發(fā)針對心肌的自身免疫反應，這需要激活浸潤的巨噬細胞、自身反應性T細胞、細胞因子以及產(chǎn)生交叉反應抗體，因此，可以將VMC的發(fā)病機制視為一種炎癥過程[8]。由于人類VMC的確切病理生理機制仍未完全明了，因此，該病的診斷和治療仍然具有較大的挑戰(zhàn)性。目前，心內(nèi)膜心肌活檢結合組織學、免疫學和分子學技術有助于VMC的診斷。然而，由于在VMC的早期疾病階段僅存在少數(shù)淋巴細胞浸潤位點，因此仍難以獲得準確的診斷。

越來越多的研究表明，AhR是一種重要的疾病調(diào)節(jié)劑，尤其是AhR在調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應中具有關鍵作用。已知AhR與多種由免疫或炎癥過程驅(qū)動的疾病有關，包括重度抑郁癥、多發(fā)性硬化癥、類風濕性關節(jié)炎、哮喘等[9,10]。作為一種高度保守的核受體，AhR可在配體結合后調(diào)節(jié)基因表達，因此，AhR影響免疫或炎癥疾病的機制可概括為靶向基因表達。關于AhR在各種疾病引起的心臟功能異常中作用也已有相關報道，且多項研究表明AhR參與了心血管結構及功能異常的發(fā)病機制，例如，AhR通過增強c-Jun/HIF-1α信號傳導促進血管緊張素Ⅱ誘導的小鼠心臟纖維化，由此表明了AhR信號通路在心臟纖維化發(fā)展中的致病作用[11]；在心肌細胞中消融AhR基因可保護雄性小鼠免受因NKX2.5單倍體不足引起的心臟功能障礙[12]。由此推測，抑制AhR可能在一些疾病中發(fā)揮組織保護作用。鑒于上述內(nèi)容，本研究通過在CVB3誘導VMC小鼠模型后給予AhR抑制劑CH223191作用，檢測結果顯示出小鼠心功能得到恢復，心肌組織炎性細胞浸潤及損傷現(xiàn)象得到有效緩解，這表明抑制AhR對CVB3誘導VMC小鼠心功能及心肌組織損傷起到保護作用。

細胞焦亡是一種程序性細胞死亡途徑，其特征是DNA裂解、細胞膜孔形成、細胞內(nèi)容物釋放和細胞腫脹，其發(fā)生取決于炎癥因子的激活。NLRP3可以通過識別同源配體與ASC結合形成分子復合物，觸發(fā)形成炎癥小體以激活caspase-1，活化的caspase-1促進IL-1β和IL-18的成熟從而誘導炎癥反應及caspase-1介導的細胞焦亡；GSDMD在細胞焦亡中作為效應分子，其既是caspase-1的下游分子，又是NLRP3炎性體的上游激活蛋白，此外，GSDMD也能夠通過促進IL-1β分泌來誘導細胞焦亡[13,14]。本研究結果顯示，在CVB3誘導VMC小鼠中使用AhR抑制劑CH223191作用后，心肌組織內(nèi)NLRP3陽性表達率和GSDMD陽性表達率均降低，caspase-1、ASC、NLRP3及GSDMD在mRNA和蛋白上的表達水平均下調(diào)，說明心肌組織內(nèi)細胞焦亡受到抑制，這一現(xiàn)象可能與抑制AhR后發(fā)揮的心肌保護功能相關。

綜上所述，對于CVB3誘導VMC小鼠而言，通過靶向抑制AhR能夠改善心功能障礙，減輕心肌損傷，并抑制心肌細胞焦亡。本研究初步明確了AhR在CVB3誘導的VMC動物模型中的作用及機制，豐富了VMC相關潛在疾病標志物和治療靶點，但該結果能否用于臨床治療工作中，有待后續(xù)進行深入探討。