骨肉瘤組織中微小RNA-650的表達變化及其意義

杜壯文， 歐陽帆， 曾繁寬

(海南省瓊海市人民醫院, 海南 瓊海 571400)

骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是一種常見的原發、高度惡化的骨惡性腫瘤，好發于青少年及兒童，局限性OS患者5年生存率為70%，復發轉移患者5年生存率不到20%[1]。盡管OS臨床治療手段不斷改進，但是術后復發、轉移率較高，生存狀況仍不容樂觀。微小RNA(micro RNA，miRNA)具有調控細胞生長、分化、增殖、凋亡等作用，參與惡性腫瘤發病過程，其中多種miRNA已被證實參與骨肉瘤發生和發展。miR-650在不同的腫瘤中表現出不同的調控作用，在膠質瘤中miR-650表達下調，轉染miR-650后細胞增殖活性明顯下降，miR-650缺乏可上調FAM83F表達促進腫瘤細胞增殖[2]。在非小細胞肺癌中miR-650表達上調，miR-650通過靶向生長抑制因子4(ING4)，調控Wnt-1/β-連環蛋白信號通路促進癌細胞的增殖和侵襲[3]。目前miR-650與OS臨床病理參數和預后暫無文獻報道，鑒于此，本研究針對miR-650在OS的表達特點，分析其臨床意義。

1 資料與方法

1.1研究對象:選擇2016年1月至2018年12月瓊海市人民醫收治的80例OS患者，其中男52例，女28例，年齡9～17(13.26±3.19)歲，腫瘤部位：股骨遠端27例，脛骨近端28例，肱骨近端21例，其他4例。腫瘤直徑2～7(5.19±2.35)cm，Enneking分期：Ⅰ期24例，Ⅱ期41例，Ⅲ期15例，淋巴結轉移15例，遠處轉移19例。納入標準：①均行外科保肢手術治療，術后病理組織學診斷為OS；②患者均首次入院糾正，術前未接受放化療等其他免疫靶向治療；③臨床基線資料、病理資料及隨訪數據完整。排除標準：①脂肪肉瘤，纖維肉瘤，或合并其他部位原發腫瘤；②慢性化膿性骨髓炎，骨折、骨結核；③中斷隨訪者?；颊呒捌浼覍倬橥夂炇鹜鈺?。

1.2miR-650表達檢測:取手術切除瘤組織及瘤旁組織(距腫瘤組織邊緣≥5cm)標本，組織研磨儀研磨后加入裂解液混勻，TRIzol試劑(美國Ambio公司)提取總RNA，M-MLV逆轉錄酶(Epicentre公司)將其逆轉錄為cDNA。取2μL cDNA樣品，CFX96實時熒光PCR儀(美國Bio-Rad)做3次平行試驗，以GAPDH RNA為內參，2-ΔΔCt計算miR-650相對表達量miR-650表達，取3次試驗平均值。引物合成及序列測定由上?；倒就瓿伞Ｒ姳?。

表1 引物序列反應條件和體系

1.3隨訪:所有患者均定期接受電話隨訪3年，統計隨訪期間生存情況，生存期定義為接受手術日期到全因死亡或隨訪結束時間。

2 結 果

2.1骨肉瘤、瘤旁組織miR-650表達比較:骨肉瘤組織與瘤旁組織miR-650相對表達量分別為5.03±1.19、1.02±0.36，骨肉瘤組織miR-650相對表達量明顯高于瘤旁組織(t=28.849，P<0.001)。

2.2miR-650表達與骨肉瘤患者病理參數的關系:miR-650表達Enneking分期 Ⅲ期、淋巴結轉移、遠處轉移有關(P<0.001)，見表2。

表2 miR-650表達與骨肉瘤患者病理參數的關系

2.3生存分析:隨訪期間死亡36例，制作生存曲線(見圖1)，經Log Rank檢驗miR-650高表達組(miR-650≥5.03，42例)OS患者3年生存率為40.48%(17/42)，低于miR-650低表達組(miR-650<5.03，38例)的71.05%(27/38)(Log Rank 2=7.103，P=0.008)。

2.4COX回歸分析:以OS患者預后為因變量(1=死亡，0=存活)，年齡(賦值：連續性變量)、性別(賦值：0=男，1=女)、腫瘤部位(賦值：0=其它，1=骨遠端，脛骨近端，肱骨近端)、腫瘤直徑(賦值：0=<5cm，1=≥5cm)、Enneking分期(賦值：0=Ⅰ、Ⅱ期，1=Ⅲ期)、淋巴轉移(賦值：0=否，1=是)、遠處轉移(賦值：0=否，1=是)、miR-650(賦值：0=miR-650<5.03，1=miR-650≥5.03)。分別采用單因素和多因素COX風險比例回歸分析影響OS患者預后的因素，最終結果顯示淋巴轉移、遠處轉移、miR-650≥5.03是OS患者死亡的危險因素(P<0.01)，見表3、4。

表3 影響OS患者預后的單因素COX回歸分析

表4 影響OS患者預后的多因素COX回歸分析

圖1 OS患者術后3年生存曲線

3 討 論

OS是威脅青少年健康和生命安全的常見骨原發惡性腫瘤，以早期肺轉移和低生存率為特征。目前OS發病機制尚未完全闡明，缺乏有效的治療手段，即便接受手術和(或)化療患者預后依然較差，因此尋找OS診斷和治療的潛在生物標志物和靶點十分重要。

miRNA是一類由20-25個核苷酸組成的非編碼單鏈RNA，具有翻譯、基因調控、轉錄后調控等作用，通過降解或抑制信使RNA參與惡性腫瘤細胞增殖分化和凋亡過程。越來越多研究表明miRNA在OS發病機制中發揮作用，其中miR-188-5p通過靶向降解CCNT2抑制骨肉瘤細胞的增殖能力[4]，miR-98-5p通過下調細胞分裂周期25調控細胞周期抑制骨肉瘤惡性增殖和進展[5]。miR-650最早被發現于人類結直腸中，通過調控靶基因表達介導細胞活性，在不同的腫瘤中表現出不同的調控作用?，F有報道顯示miR-650在肝細胞癌中表達上調，通過靶向腫瘤抑制蛋白激酶2(LATS2)參與癌細胞增殖、遷移和侵襲[6]。慢性淋巴細胞白血病患者miR-650也呈高表達，且與Binet分期、IGHV、P53基因畸變有關，miR-650通過調控腫瘤抑制基因NDRG2抑制細胞凋亡[7]。而在結腸癌中miR-650表達下調，發揮抑制癌細胞生長和侵襲作用，miR-650可能通過靶向AKT2蛋白抑制AKT通路誘導上皮型鈣黏附素(E-cadherin)表達，抑制細胞遷移和侵襲[8]。

然而miR-650與OS臨床病理參數和預后的相關報道十分少見，本研究發現miR-650在骨肉瘤組織中高表達，提示miR-650在OS中可能發揮促癌基因作用。通過分析miR-650與臨床病理參數關系發現miR-650表達與OS患者Enneking分期、淋巴結轉移、遠處轉移有關，提示miR-650過表達可能誘導OS細胞惡性增殖、侵襲和轉移，miR-650參與OS病情惡性進展過程。推測miR-650參與OS的發病機制為：①miR-650通過下調靶基因ING4表達參與腫瘤炎癥反應調節，ING4作為一種腫瘤抑制蛋白，其表達受抑制后可通過調節核轉錄因子-κB(NF-κB)活性誘導白細胞介素6(IL-6)的轉錄和分泌，IL-6促進細胞間黏附分子-1表達，調節成骨細胞和破骨細胞分化參與OS發病過程，因此miR-650可能通過ING4/NF-κB/IL-6軸參與OS發病機制[9]。②miR-650過表達通過抑制ING4表達促使OS細胞快速增殖[10]。③miR-650與ADP-核糖基化因子-1(ARF1)mRNA靶向結合，ARF具有調節肌動蛋白細胞骨架重塑、質膜重組和囊泡轉運等過程[11]，是囊泡運輸過程中通過分泌通路早期區隔的關鍵分子開關[12]，參與侵襲性乳腺癌侵襲轉移和上皮間質轉化過程以及OS破骨細胞分化過程和OS腫瘤微環境改變過程[13]，因此推測miR-650可能通過調控ARF1表達促進OS細胞上皮間質轉化誘導OS瘤細胞增殖，Enneking分期增加以及淋巴結和遠處轉移。通過隨訪調查發現，miR-650高表達與OS患者低生存率有關，COX風險比例回歸分析示miR-650高表達是OS患者預后不良的危險因素，可能與miR-650高表達促使OS細胞增殖、侵襲、轉移，導致腫瘤復發轉移有關，提示miR-650可以作為判斷OS患者預后情況的一項指標。miR-650在人體組織中表達穩定，卻對基因表達和調控具有關鍵作用，與骨肉瘤其它腫瘤標志物比較，可更敏感地反映腫瘤發生和進展，是骨肉瘤頗具前景的生物學指標。

綜上所述，骨肉瘤組織中miR-650呈高表達，miR-650表達與OS患者Enneking分期、淋巴結轉移、遠處轉移有關，miR-650高表達是OS預后不良的危險因素。miR-650有望作為OS預后預測的潛在標志物和治療的潛在靶點。