攜帶TSP-1的臍帶間充質干細胞來源外泌體對視網膜靜脈阻塞大鼠視網膜變性的保護作用

李 霞， 張茂菊

(湖北省恩施市恩施州中心醫院眼科中心， 湖北 恩施 445000)

視網膜靜脈阻塞(retinal vein occlusion，RVO)是視網膜靜脈系統充血擴張的血管性疾病，也是導致視力喪失和視力障礙的常見眼科疾病。由于靜脈血流速度緩慢，其嚴重程度雖不如動脈閉塞嚴重，但靜脈閉塞潛伏期較長，起病緩慢且病程長，病情十分頑固[1]。RVO與高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化、高膽固醇等全身性疾病密切相關[2]。此外，RVO的發病率與年齡密切相關，其發病率隨著年齡的增長而增加，現已成為僅次于糖尿病視網膜病變的第二大致盲性眼底病。間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)因其多向分化能力，現已被公認為是治療多種疾病的有力工具，臨床應用非常廣泛。人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell，hUCMSC)作為MSC的一種，不僅具有MSC的所有生物學特性，而且還表現出良好的增殖分化潛能和低免疫原性，而且可以通過非侵入性的方式獲得[3]。目前研究表明，MSC的大部分治療益處來自旁分泌釋放的可溶性因子[4]。外泌體是從細胞向胞外分泌的膜質納米囊泡，直徑大小在10～100nm之間，包含蛋白質、mRNA和miRNA等分子，可作為細胞間通訊的調節劑，將多種特異成分轉運到靶細胞。血小板反應素-1(thrombospondin-1，TSP-1)是一種細胞外基質蛋白，可與多種配體相互作用，包括細胞受體、生長因子、細胞因子和蛋白酶，以調節各種生理和病理過程，現已表明TSP-1介導免疫調節、炎癥反應和傷口愈合的功能，此外，還能夠抑制新生血管的生成[5,6]。本研究通過從攜帶TSP-1的hUCMSC中分離出外泌體，并將其應用于RVO大鼠模型治療中，觀察這一來源的外泌體對RVO病變的影響，以期為RVO的治療提供新方案。

1 材料與方法

1.1實驗動物：SPF級雄性SD大鼠，6月齡，體重400～500g，由湖北省實驗動物研究中心提供。適應性飼養1周后開始實驗。飼養溫度為22～24℃、相對濕度為(50±5)%，每日光照/黑暗交替12h，環境經嚴格滅菌處理，期間自由飲水飲食。本研究獲得我院倫理委員會審批通過。

1.2主要材料與試劑:hUCMSC(上海弘順生物)，胰蛋白酶、胎牛血清和α-MEM完全培養基(美國Gibco)，嘌呤霉素(德國Merck)，Trizol試劑盒(美國Invitrogen)，SensiFast cDNA Synthesis試劑盒和SensiFast SYBR Green Hi-ROX試劑盒(美國Bioline)，BCA蛋白測定試劑盒、PVDF膜和ECL化學發光液(上海碧云天)，Exosomes提取試劑盒(上海貝博生物)，孟加拉紅和HE染色試劑盒(北京百奧萊博)，復方托吡卡胺(日本參天制藥株式會社)，愛爾凱因(美國Alcon-Couvreur)，迪可羅眼膏(沈陽興齊制藥)，熒光素鈉溶液(美國Alcon公司)。抗體CD9、CD63、Alix、HIF-1α、VEGF、VCAM-1、GAPDH以及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(英國Abcam公司)，慢病毒載體構建、包裝、滴度測定以及基因引物序列合成交由上海生工生物公司完成。

1.3方 法

1.3.1細胞分組與轉染:將hUCMSC復蘇，接種在培養瓶內，添加含10%胎牛血清的α-MEM完全培養基培養，待細胞融合度達到80%時，0.125%胰蛋白酶室溫消化并傳代。取培養至第三代的hUCMSC接種于培養瓶，使用含TSP-1基因序列-綠色熒光蛋白標記的慢病毒懸液或陰性對照-綠色熒光蛋白標記的慢病毒懸液感染hUCMSC，分別記為NC-hUCMSC組和TSP-1-hUCMSC組，同時加入感染增強液，混合均勻，病毒復感染指數MOI=10，感染24h更換含嘌呤霉素的完全培養基進行篩選，48h后經熒光顯微鏡下觀察慢病毒載體感染后GFP的表達。同時以正常培養的hUCMSC作對照，分別采用實時熒光定量PCR和Western blot檢測細胞內TSP-1的mRNA和蛋白水平表達情況。

1.3.2實時熒光定量PCR:在感染后hUCMSC和各組大鼠視網膜組織中加入Trizol，按說明書操作提取細胞或組織總RNA，微量分光光度計測定總RNA純度與濃度，1.5%凝膠電泳檢測RNA完整性。利用Sensi Fast c-DNA試劑盒將總RNA反轉錄合成cDNA，再以獲得的cDNA為模板，通過熒光定量PCR儀擴增檢測各基因的mRNA表達水平，參照SensiFast SYBR Green Hi-ROX試劑盒說明書進行，擴增程序設置為： 95 ℃ 2min； 95 ℃ 5s和60℃ 10s，共40個循環。實驗重復3次，以GAPDH作為內參基因，2-ΔΔCt法計算各目的基因表達量。Primer premier 5.0設計各基因引物序列，詳見表1。

表1 各基因引物序列

1.3.3Western blot:使用RIPA裂解液提取感染后hUCMSC、外泌體以及各組大鼠視網膜組織的總蛋白，添加試劑液后置于冰上裂解40min，以12000 r/min離心30min，取上清，BCA法定量蛋白。制備10%SDS-PAGE凝膠，取提取的各組蛋白樣品等量上樣，進行電泳分離蛋白，將分離后的蛋白切膠后電轉至PVDF膜，將膜在5%脫脂奶粉中室溫封閉1h，加入稀釋后的各一抗，4℃孵育過夜；次日，棄去原液，TBST充分洗膜，加入稀釋后的對應二抗，室溫孵育1h，TBST洗膜，利用ECL試劑顯影，凝膠系統成像，Image Pro-Plus軟件分析各蛋白條帶灰度值，以GAPDH作為內參蛋白。

1.3.4外泌體的提取與鑒定:收集感染的hUCMSC細胞培養上清液，將上清液置于4℃低溫離心機中以3,000g離心15min，棄沉淀，轉移上清液至新離心管內，在4℃低溫離心機中以10,000g離心20min，棄沉淀，收集上清并轉移至新離心管，加入外泌體提取試劑液A，上下顛倒混合均勻，4℃靜置12h。將混合液在4℃低溫離心機中以10,000g離心60min，移除上清液，收集沉淀，加入保存液試劑B重懸沉淀，保存樣品于-80℃冰箱。制備樣品，通過透射電子顯微鏡觀察形態，納米粒子跟蹤分析法測定粒度直徑，Western blot檢測外泌體的標志蛋白CD9、CD63及Alix表達情況。

1.3.5動物模型制備[7]與分組處理:將SD大鼠通過腹腔注射10g/L戊巴比妥鈉(40mg/kg)麻醉后，全身消毒，右眼滴復方托吡卡胺散瞳10min，愛爾凱因滴眼麻醉眼表，經尾靜脈緩慢注入0.25mL的5%孟加拉紅(50mg/kg)。給藥5min后，大鼠角膜上安置滴加迪可羅眼膏的三面鏡，選擇伴行動脈距離較遠的靜脈，從靜脈血管遠端開始，采用波長532nm的眼底激光儀進行激光照射，每只眼間隔選3支靜脈血管建立RVO模型，激光功率為60mW，光斑直徑60μm，激光照射時間0.4s。血管變細后，增加參數照射近端血管，激光功率改為80mW，光斑直徑100μm，激光照射時間0.5s，觀察血流完全中斷，形成1個視盤直徑左右的血栓或阻塞，每支血管平均照射25點。建立大鼠RVO模型后，避光12h。造模的大鼠隨機分為模型組、hUCMSC-Exo組、TSP-1-hUCMSC-Exo組，每組10只，另取10只健康大鼠作為對照組，hUCMSC-Exo組結膜下注射100μL hUCMSC的外泌體，TSP-1-hUCMSC-Exo組注射100 μL含TSP-1慢病毒感染的hUCMSC的外泌體，同時，對照組和模型組注射等體積的磷酸鹽緩沖液。

1.3.6眼底成像觀察:RVO模型建立后1d、7d、14d、21d，麻醉對照組和模型組的大鼠，以復方托吡卡胺滴眼散瞳，使用動物Micron III眼內成像系統拍攝眼底圖像，觀察眼底變化情況，判斷造模結果。

1.3.7眼底血管熒光造影:在21d后，將各組大鼠麻醉，以復方托吡卡胺滴眼散瞳，腹腔注射100μL熒光素鈉溶液(0.5mg/L)，注射5min后，立即進行觀察、拍照，檢測視網膜內血管變化情況。

1.3.8HE染色:眼底成像和血管熒光造影結束后，處死各組大鼠并取其視網膜組織，清洗干凈，置于4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，利用切片機連續切片，制備厚度為5μm的組織切片。切片經脫蠟水化處理后，放入蘇木素溶液中染色5min，流水沖洗，鹽酸-乙醇分化數秒，伊紅染液浸泡復染3min，常規脫水與透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察視網膜結構變化，并拍照。

2 結 果

2.1慢病毒感染hUCMSC效率檢測:通過熒光倒置顯微鏡觀察到轉染慢病毒的NC-hUCMSC組和TSP-1-hUCMSC組細胞內出現大量綠色熒光，轉染效率均達到85%以上，見圖1A。實時熒光定量PCR和Western blot檢測結果顯示，與hUCMSC組和NC-hUCMSC組比較，TSP-1-hUCMSC組的hUCMSC中TSP-1 mRNA相對表達量和蛋白相對表達量均顯著升高(P<0.05)，見圖1B、1C。

圖1 慢病毒感染hUCMSC效率

2.2外泌體鑒定:透射電鏡觀察到分離的顆粒物為球狀，呈典型的膜性小囊泡，粒度直徑大約分布在100nm，見圖2A與圖2B。此外，Western blot檢測到細胞外囊泡標志蛋白CD9、CD63及Alix均高表達，以上結果表明成功分離到外泌體。

圖2 外泌體鑒定

2.3RVO模型判定:眼底圖像顯示，對照組大鼠在1、7、14和21d時，視網膜均表現出正常外觀，未見異常現象；模型組大鼠在造模1d后，出現白色閉塞血管，以及白色缺血性斑塊，在7d白色閉塞血管十分明顯，缺血性斑塊數量較多，在14d和21d表現為血管閉塞略有減輕，仍可見缺血性斑塊，見圖3，表明RVO大鼠模型構建成功。

圖3 造模后大鼠眼底圖像變化

2.4眼底血管熒光造影觀察結果:FFA結果顯示，對照組視網膜血管呈放射狀，靜脈管徑均勻，充盈良好，未見熒光滲漏；模型組視網膜血管可見阻塞的靜脈迂曲擴張，粗細不均，血管壁熒光著染、滲出；hUCMSC-Exo組視網膜血管壁有少量熒光著染，可見血管再通；TSP-1-hUCMSC-Exo組視網膜視網膜血管未見明顯異常和熒光滲漏的現象，見圖4。

圖4 各組大鼠FFA圖像

2.5視網膜組織病理學形態染色結果:經過觀察HE染色結果可見，對照組視網膜組織結構完整，未見病理學損傷；模型組視網膜組織結構明顯受損，內界膜和內核層均被內層滲出的漿液分離，視網膜色素上皮細胞遭到破壞，視網膜厚度不均；相較于模型組，hUCMSC-Exo組和TSP-1-hUCMSC-Exo組的視網膜結構損傷現象均有所減輕，其中，TSP-1-hUCMSC-Exo組改善現象更加明顯，各層結構較為清晰，見圖5。

圖5 各組大鼠視網膜組織HE染色(×100)

2.6視網膜組織中HIF-1α、VEGF與VCAM-1表達的測定結果:實時熒光定量PCR和Western blot實驗檢測結果顯示，與對照組比較，模型組視網膜組織中HIF-1α、VEGF與VCAM-1的mRNA和蛋白相對表達量均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，hUCMSC-Exo組和TSP-1-hUCMSC-Exo組的HIF-1α、VEGF、VCAM-1 mRNA和蛋白相對表達量均顯著降低(P<0.05)；同時，TSP-1-hUCMSC-Exo組的HIF-1α、VEGF、VCAM-1 mRNA和蛋白相對表達量均顯著低于hUCMSC-Exo組(P<0.05)，見圖6與圖7。

圖6 實時熒光定量PCR檢測視網膜組織中HIF-1α、VEGF與VCAM-1的mRNA表達水平

圖7 Western blot檢測視網膜組織中HIF-1α、VEGF與VCAM-1的蛋白表達水平

3 討 論

RVO通常發生于老年人、高血壓患者以及心血管疾病患者中，作為第二大常見的視網膜血管疾病，RVO可引起視網膜毛細血管失代償，甚至無痛性完全失明[2]。然而，其發病機制仍未完全闡明，目前，一些針對血栓形成的治療方法，如等容血液稀釋療法、抗血小板藥物、低分子量肝素和纖維蛋白溶解等在RVO治療中獲得了良好結果[8]。然而，這些方法或藥物并不是完全有效的，需要通過對RVO的病因和病理機制進行透徹了解，制定新的治療方案以實現理想的治療目標。

越來越多的研究表明，MSC來源的外泌體作為一種新的細胞間通訊機制在各種疾病治療中具有較大潛力，外泌體可以通過多種機制被吸收，包括膜融合、內吞作用和與細胞表面受體的結合等，從而改變靶細胞的生物行為，成為了許多疾病治療的新途徑[9]。例如，Zhang等[10]報道表明hUCMSC來源的外泌體通過調控Wnt-4信號通路在皮膚傷口愈合中發揮積極作用；Li等[11]通過將hUCMSC來源的外泌體用于治療四氯化碳誘導的小鼠肝纖維化中，發現hUCMSC來源的外泌體通過滅活TGF-β1/Smad途徑來抑制肝細胞上皮間質轉化，改善肝損傷以及肝纖維化。此外，外泌體已成為新型納米蛋白質藥物的遞送載體，可通過加載藥物或遺傳因子發揮相應作用，內源性負載是目前常用的方式之一，即在供體細胞上經基因修飾將基因產物加至外泌體中從而進行靶向傳送。在本研究中，通過慢病毒轉染法在hUCMSC中攜帶TSP-1后再分離外泌體，進而探究經TSP-1修飾的hUCMSC來源的外泌體對RVO大鼠的作用情況。

TSP-1作為細胞外基質蛋白家族成員之一，在一系列組織中表達，包括角膜、晶狀體、視網膜色素上皮等，通過與多種細胞受體相互作用來調節細胞功能，并介導TGF-β相關的免疫調節和傷口愈合功能[12]。研究表明，TSP-1在多種眼科疾病中發揮作用，例如，Tan等[13]通過重組TSP-1滴眼對干眼病C57BL/6小鼠進行局部治療，發現應用重組TSP-1可減少角膜DC成熟，降低促炎細胞因子IL-1β、IL-6、IL-23和IL-17A的表達，改善干眼癥小鼠的疾病嚴重程度；Blanco-Mezquita等[14]通過對野生型和TSP-1缺陷的兩種小鼠創建全層穿透角膜切口，發現TSP-1缺陷小鼠的傷口表現出慢性水腫和持續性傷口裂開，由此推測，TSP-1的缺失會導致角膜傷口炎癥反應延長和傷口愈合延遲。在本研究中，經過使用攜帶TSP-1的hUCMSC來源的外泌體治療RVO大鼠后，觀察結果顯示RVO大鼠視網膜血管熒光滲漏現象明顯減少甚至消失，視網膜組織形態趨于正常，這表明攜帶TSP-1的hUCMSC來源的外泌體對RVO大鼠視網膜損傷變性具有良好的治療效果。

此外，TSP-1能夠以多種方式抑制血管形成與生長，包括拮抗VEGF、誘導血管內皮細胞凋亡以及調節內皮細胞增殖、遷移。其中，TSP-1通過直接與VEGF結合或抑制基質金屬蛋白酶活性來限制VEGF從細胞外基質中的釋放，其還能夠通過阻斷VEGF信號轉導來抑制VEGF受體2的磷酸化，進而起到抑制VEGF活性的作用。可見，TSP-1是一種有效的新生血管形成的內源性蛋白抑制劑。在RVO中，VEGF是導致該疾病發生的一個關鍵因子，能夠通過促進VCAM-1的高表達來介導血管內皮細胞與白細胞、中性粒細胞之間的粘附結合作用，造成血液流動受阻，加重視網膜的缺氧缺血進而造成組織損傷。而當缺氧發生時，HIF-1α的進一步激活又促進了VEGF和VCAM-1的釋放，由此形成了一個惡性循環網絡。在本研究中，RVO大鼠視網膜組織內HIF-1α、VEGF和VCAM-1的表達水平異常升高，經攜帶TSP-1的hUCMSC來源的外泌體治療RVO大鼠后，視網膜組織內HIF-1α、VEGF以及VCAM-1的表達水平均明顯下調，由此推測，該治療作用可能與下調HIF-1α、VEGF和VCAM-1的表達相關。

綜上所述，經過攜帶TSP-1的hUCMSC來源外泌體治療RVO大鼠模型后，改善了視網膜微循環，緩解RVO造成的視網膜血管滲漏及組織變性損傷，這一作用可能與抑制HIF-1α、VEGF以及VCAM-1的表達相關。