ATP-TCA 檢測在多發性骨髓瘤患者中的應用價值分析

趙 凡，夏瑞祥（通信作者）

（安徽醫科大學第一附屬醫院血液科 安徽 合肥 230022）

多發性骨髓瘤（MM）是一種漿細胞在骨髓中積累，導致骨破壞和骨髓衰竭的惡性腫瘤。治療上對于全身體能狀態良好的患者首選誘導治療后行自體造血干細胞移植（ASCT），對于不適合ASCT 的患者選擇誘導治療至最大緩解程度后維持治療。近些年，第3 代免疫調節劑泊馬度胺、第2 代蛋白酶體抑制劑卡非佐米、CD38 單抗等藥物的出現顯著提高了MM 患者的療效，但在整個治療過程中，患者反復復發，將不可避免地面臨藥物的耐藥，因此個體化選擇給藥方案，選擇合適的藥物組合，降低治療成本至關重要。ATP-TCA 是一種檢測腫瘤細胞體外藥物敏感性的一種方法，在新藥開發、耐藥機制研究及臨床決策中均有良好應用。目前已證實該項技術在多種實體腫瘤中的應用價值，在血液系統疾病的新藥開發及指導臨床用藥中也有廣泛使用，但是目前為止該項技術在MM 中鮮有報道，因此我們收集了多發性骨髓瘤患者的腫瘤體外藥敏結果及其他臨床數據來論證ATPTCA 對指導MM 臨床治療的適用性，現報道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

收集2020 年6 月—2021 年3 月就診于安徽醫科大學第一附屬醫院的63 例多發性骨髓瘤患者的骨髓標本，納入標準：①符合2016 年國際骨髓瘤工作組（IMWG）多發性骨髓瘤診斷標準，經骨髓細胞學、免疫固定電泳、免疫球蛋白、影像學等檢查明確診斷為活動性多發性骨髓瘤；②預計生存時間≥3 個月；③簽署知情同意書，同意行骨髓采樣送檢。排除標準：①合并有其他的危重癥疾病以及預計生存時間不滿3 個月；②一般情況差不能耐受骨髓穿刺檢查；③非初診初治患者既往接受過除化療以外的其他類型的治療（自體造血干細胞移植、免疫治療等）。63 例患者包括男性36 例，女性27 例，平均年齡66 歲（45 ～89 歲）。免疫球蛋白類型：IGA 12 例，IGD 2 例，IGG 39 例，IGM 1 例，κ 輕鏈2 例，λ 輕鏈7 例。

1.2 方法

1.2.1 材料來源 所有的ATP-TCA 標本均采集患者骨髓血，樣本采集后于48 h 內低溫4 ℃送檢，標本送至安徽省精準用藥技術工程實驗室進行檢測。生物培養基及細胞提取液、藥敏試劑盒均購買自中科普瑞昇生物有限公司，化療藥物購買自MedChemExpress（MCE）。

1.2.2 ATP 檢測方法 細胞分離：將采集的骨髓標本混勻離心后將血細胞沉淀注入淋巴細胞分離液中，吸取淋巴細胞層，加入紅細胞裂解液后加入培養基重懸細胞沉淀，備用。細胞質檢：取少量樣本加入臺盼藍混合后加入計數板，電腦軟件計數大細胞和存活細胞比例，采用流式細胞術通過檢測CD38（+）、CD138（+）、CD19（-）、CD56（+）抗原確定惡性漿細胞比例。細胞培養：將細胞加入培養基中后分別接種于高通量培養板中（雙孔復測），不加藥物的細胞作為空白對照，置37 ℃、5%二氧化碳培養箱中培養，72 h 后檢測生長情況。ATP 檢測：加入CTG 化學發光細胞活性檢測試劑盒后放入儀器測量發光值。

1.2.3 ATP-TCA 結果判定

以100%峰值血漿濃度（PPC）為篩選濃度，評估藥物對自體癌細胞的細胞毒作用，抑制率越高，細胞毒作用越強；抑制率（%）=（1-藥物篩選組腫瘤細胞存活數目/空白對照組腫瘤細胞存活數目）×100%。為方便統計將抑制率≥50%定義為藥物敏感，抑制率＜50%定義為不敏感。

1.3 臨床結果的評估和定義

參考2016 年IMWG 更新的傳統療效評價標準將療效分為完全緩解（CR）；非常好的部分緩解（VGPR）；部分緩解（PR）；疾病穩定（SD）；疾病進展（PD）；嚴格意義的完全緩解（sCR）定義為滿足CR 標準的基礎上，加上血清游離輕鏈比值正常以及經免疫組化證實骨髓中無克隆性漿細胞，可以用敏感性達到10的多色流式細胞術檢測骨髓標本無克隆漿細胞代替。

1.4 統計學方法

實驗結果采用SPSS 23.0 軟件進行分析。不同藥物種類組合間差異采用單因素協方差分析；體外敏感度的影響因素中分類變量采用χ檢驗，連續變量采用Person 相關性分析；藥敏結果與臨床數據及臨床療效的相關性采用有序logistics 回歸。≤0.05 為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 藥物體外敏感度的組間差異分析

體外藥物及藥物組合共7 組。各組抑制率以均數及標準差的形式表示：硼替佐米+來那度胺+地塞米松組（72.30%±22.38%）＞硼替佐米+環磷酰胺+地塞米松組（70.64%±23.61%）＞硼替佐米組（58.05%±28.95%）＞美法侖+潑尼松+沙利度胺組（16.15%±16.16%）＞來那度胺+地塞米松組（16.14%±13.73%）＞環磷酰胺組（11.76%±11.56%）＞來那度胺組（8.93±10.71%）。各組間差異顯著，（WelchF = 152.171，＜0.001），見圖1。

圖1 藥敏結果的組間差異

2.2 藥敏結果和療程對緩解程度的影響

研究過程中共36 例患者接受了不少于2 個療程的化療并進行了療效評估，根據患者所采用的臨床方案對應的ATP-TCA 數據，將敏感度≥50%分為敏感組，敏感度＜50%分為不敏感組，敏感組29 例，不敏感組7 例，運用有序logistics 回歸分析腫瘤藥物體外敏感性及療程對于緩解程度的影響。敏感組的緩解程度明顯高于不敏感組，OR 值是不敏感組的8.89 倍（95%：3.38 ～4.04，χ= 19.61，＜0.001）；隨著療程數的增多，緩解程度有所升高，8 個療程后療效的OR 值是2 個療程的6.43 倍，（95%：2.14 ～19.33，χ= 11.00，= 0.001），見圖2。敏感組sCR 的獲得高于不敏感組，（= 0.028）。

圖2 藥敏結果對緩解程度的影響

2.3 體外敏感度與臨床特征的相關性

根據ATP-TCA 中蛋白酶體敏感性的結果，將患者分為敏感組和不敏感組，在骨髓FISH 檢測中，29 名患者檢出高危染色體異位，含一項高危因素的有21 例，兩項高危因素的有7 例，三項高危因素的有1 例，兩組間無顯著差異（= 0.761）；兩組間免疫表型（CD19, CD20,CD56, CD3, CD4, CD7, CD13, CD33, CD117），高乳酸脫氫酶（LDH），腎功能不全，高鈣血癥，低蛋白血癥均無顯著差異，（＞0.05），見表1。

表1 組間臨床特征差異

2.4 體外敏感度對生存的影響

最終47 例患者接受了不少于3 個月的隨訪，根據患者所采用的臨床方案的敏感性分為敏感組和不敏感組，其中敏感組35 例，不敏感組12 例，中位隨訪16 個月后敏感組總生存期（OS）28.5 個月（95%：26.64 ～30.49） 高 于 不 敏 感 組17.8 個 月（95%：13.5 ～22.1），差異顯著（χ= 7.38，= 0.007）；敏感組無進展生存期（PFS）27.55 個月（95%：24.48 ～30.61）高于不敏感組16.76 個月（95%：12.47 ～21.04），差異顯著（χ= 9.315，= 0.002），見圖3。

圖3 組間生存差異

3.討論

腫瘤是目前臨床上常見的致死性疾病之一，因為其遺傳學上的特征，極易在體內生長擴散且極難根治。雖然大量新藥以及免疫療法的出現顯著改善了患者預后，但化療作為貫穿全程的一部分，最終都將面臨腫瘤耐藥以及嚴重不良反應的威脅，因此通過“精準用藥”，找到最合適的治療方法至關重要。在傳統的腫瘤藥物敏感性檢測實驗中，因骨髓瘤細胞的不均質性，不同個體的骨髓瘤細胞比例差異大，直接進行藥敏檢測難以區分正常細胞和癌細胞，因此我們采用流式細胞術，通過檢測骨髓瘤細胞特異性抗原對細胞進行分類，確保了骨髓瘤細胞的比例在50%以上，并且采用有選擇性培養基進行培養，從而減少了非惡性漿細胞所引起的誤差。

在納入的7 種臨床常用的單藥及聯合組別中，含PIs的方案敏感度更高，這與目前臨床上的數據相符。MPT方案表現為體外耐藥，這與其抗腫瘤機制有關，烷化劑類藥物主要通過烷化作用形成DNA 鏈間或鏈內的交聯或DNA 與蛋白質之間的交聯，屬于細胞周期特異性藥物，而藥敏檢驗周期短，在這個過程中癌細胞只需保持存活，不需要分裂。

在臨床療效方面，敏感組的患者無論是緩解的深度還是生存的時間都有明顯獲益。但值得一提的是，有兩例敏感組的患者出現了短期內再次復發。在歐洲的一項關于早期復發的模型預測中，對2 190 例患者依據高LDH、FISH 高危因素、低蛋白血癥、骨髓漿細胞數和血游離輕鏈，進行了多發性骨髓瘤簡化早期復發（S-ERMM）的評分，結果提示S-ERMM 評分高者易復發，這兩例早期復發的患者均為高危型復發型患者，因此臨床上對于高風險的患者，我們仍需要引起重視。除此之外，MM 的腫瘤微環境（TME）復雜多變，各種免疫細胞亞群、細胞因子等參與腫瘤的發生與耐藥，一些針對靶向微環境的藥物依賴于髓內微環境發揮作用，體外培養的過程難以復刻髓內環境，因此ATP-TCA 僅作為臨床用藥的參考而不能替代實際的療效。通過這項研究我們發現了ATP-TCA 檢測與臨床療效有相關性，可以作為臨床藥物選擇的參考依據。