跨越式滾環等溫擴增技術結合CRISPR/Cas12a定量檢測海產品中的副溶血性弧菌

董換哲，苑 寧，張蘊哲，楊 倩,3,*，盧 鑫，郭 威，張 偉,4,5,*

（1.河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071001；2.河北農業大學理工學院，河北 滄州 061100；3.河北大學公共衛生學院，河北 保定 071002；4.河北農業大學生命科學學院，河北 保定 071001；5.河北省人畜共患病原微生物分析與防控重點實驗室，河北 保定 071001）

副溶血性弧菌（）是一種廣泛存在于各種海產品中的食源性致病菌。在我國沿海地區，副溶血性弧菌是發生細菌性食源性疾病的主要致病菌。食用受副溶血性弧菌污染的生的或未煮熟的海產品，可能會引起人類患胃腸道疾病，其臨床癥狀包括腹瀉、腹部痙攣、嘔吐、發燒或發冷。此外，副溶血性弧菌也可通過開放性傷口傳播，甚至可導致敗血癥，嚴重時可危及生命。根據GB 29921ü2013《食品中致病菌限量》規定，海產品中副溶血性弧菌含量應低于10CFU/g，從而降低由副溶血性弧菌引起的感染風險。因此，為有效監測食品安全問題，開發快速且靈敏的副溶血性弧菌定量檢測方法具有重要現實意義。

傳統培養方法、免疫學方法、核酸擴增技術等是目前國內外檢測副溶血性弧菌的主要方法。傳統培養方法對副溶血性弧菌的檢測準確、可靠，但至少需要3～5 d才能獲得最終結果，且靈敏度低，在快速檢測中應用受限；免疫學檢測方法易受食品基質影響，從而導致該方法靈敏度較低、特異性較差；核酸擴增技術中的核酸等溫擴增反應在同一溫度下對靶標進行快速擴增，對儀器要求較低，通過金屬浴、水浴鍋等簡單的設備即可完成反應。本實驗室研究團隊基于酶擴增DNA的一種新特性，創建了跨越式滾環等溫擴增技術（saltatory rolling circle amplification，SRCA）。SRCA無需人為環化模板，在等溫條件下僅需1 對引物便可完成對線性DNA的擴增，是一種新型核酸等溫擴增技術。

成簇規律間隔短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）及其相關蛋白（CRISPR associated protein，Cas）組成了CRISPR/Cas系統，是細菌和古細菌中的一種獲得性免疫機制。最近的研究發現，Cas12a可在CRISPR RNA（crRNA）引導下靶向結合雙鏈DNA，產生對單鏈DNA（single strand DNA，ssDNA）的非特異切割活性。由于CRISPR/Cas12a系統特異性識別以及裂解DNA序列的能力，近年來被用于開發新型核酸檢測平臺。

基于此，本研究將SRCA擴增反應與CRISPR/Cas12a系統結合，建立一種檢測副溶血性弧菌的新方法。檢測原理如圖1所示，首先利用SRCA反應進行核酸擴增，產生許多串聯重復的靶標序列；然后利用設計的crRNA特異性識別擴增靶標，從而使Cas12a產生對ssDNA的切割活性。利用此特性切割體系內ssDNA報告探針，使得修飾在探針兩端的熒光基因和猝滅基團遠離發出熒光信號，最后通過熒光信號變化判定結果，從而建立SRCACas12a檢測方法，并將該方法應用到海產品中副溶血性弧菌的定量檢測。

圖1 SRCA-Cas12a檢測副溶血性弧菌原理圖Fig.1 Schematic illustration of the principle of SRCA-Cas12a for the detection of V.parahaemolyticus

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

副溶血性弧菌（CICC 21617、CICC 21528、ATCC 17802）、溶藻弧菌（CICC 21664）、創傷弧菌（CICC21615）、大腸埃希氏菌（CMCC 44103）、鼠傷寒沙門氏菌（CMCC 50115）、腸炎沙門氏菌（CMCC 50041）、單核細胞性李斯特菌（CMCC 54001）、金黃色葡萄球菌（CMCC 26003）、福氏志賀菌（ATCC 12022）、宋內氏志賀菌（CMCC 51334）、銅綠假單胞桿菌（CICC 21636）均由本實驗室提供保藏；本研究所用序列交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（并通過聚丙烯酰氨凝膠電泳進行純化）；細菌全基因組DNA提取試劑盒 北京全式金生物技術有限公司；DNA聚合酶、Cas12a蛋白 美國NEB有限公司；dNTPs、無酶無菌水 北京博邁德基因技術有限公司；所有溶液均采用無酶無菌水配制。

1.2 儀器與設備

DK-8D三孔電熱恒溫水槽 上海一恒科學儀器有限公司；Nanodrop 2000分光光度計 美國Thermo Scientific有限公司；DXY-33A型電泳儀 北京六一儀器廠；JY04S-3E凝膠成像儀 北京君意電泳設備有限公司；F-320熒光分光光度計 天津港東科技發展股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細菌培養及核酸提取

副溶血性弧菌在3%氯化鈉堿性蛋白胨水中培養，其他菌株在LB培養基中培養，過夜培養得到菌懸液，按照細菌全基因組DNA提取試劑盒說明書，取1 mL菌懸液提取DNA。

1.3.2 引物設計

選取副溶血性弧菌的基因為特異性靶基因，通過BLAST同源性比對后，選取的副溶血性弧菌GenBank序列號為L11929.1。利用Primer Premier 5.0和DNAMAN軟件設計SRCA反應的正向引物和反向引物，引物序列信息見表1。

表1 序列信息Table 1 Sequence information of primers used in this study

1.3.3 SRCA擴增反應

SRCA預反應體系為20.0 mmol/L Mg3.0 μL、2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL、10hThermoPol Reaction Buffer 2.0 μL、模板DNA 1.0 μL、10.0 μmol/L正、反向引物各1.0 μL、DNA聚合酶（8 000 U/mL）1.0 μL，添加無酶無菌水將體系補足至20.0 μL，62 ℃反應50 min。反應產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析。

1.3.4 crRNA以及ssDNA報告分子的合成

crRNA由直接重復序列和間隔序列組成，在CRISPR/Cas12a系統中，形成莖環結構的直接重復序列為UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU，間隔序列與檢測序列互補。在副溶血性弧菌檢測序列中找到一個用于激活Cas12a蛋白的富含T核苷酸的原間隔鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM）（TTTN，N代表A、T、G或C），crRNA的間隔序列與PAM的下游序列（約21 bp）相同，其中T被U取代。ssDNA報告分子選用FAM和BHQ1探針分別修飾兩端。crRNA及ssDNA的序列信息見表1。

1.3.5 CRISPR/Cas12a剪切反應

CRISPR/Cas12a檢測體系包括1.0 μmol/L Cas12a 1.0 μL、1hNEBuffer 5.0 μL、1.0 μmol/L crRNA 5.0 μL、1.5 μmol/L ssDNA報告分子5.0 μL、SRCA擴增產物5 μL，添加無酶無菌水將體系補足至50.0 μL，37 ℃反應15 min，反應結束后取出反應樣品移至熒光比色皿中，熒光分光光度計設置激發波長為492 nm，發射波長為510～700 nm，進行熒光光譜檢測。以有靶標時的熒光強度與無靶標時的熒光強度的比值表示。

1.3.6 SRCA-Cas12a條件優化

為進一步優化檢測性能，分別優化ssDNA探針濃度、Cas12a/crRNA濃度比、Cas12a剪切反應時間。ssDNA探針濃度設置6 個梯度，依次為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μmol/L。固定Cas12a濃度為1 μmol/L，Cas12a/crRNA濃度比設置8 個梯度，依次為2∶1、4∶3、1∶1、4∶5、2∶3、1∶2、2∶5、1∶3。Cas12a剪切反應時間依次設置為5、10、15、20、25、30 min。

1.3.7 SRCA-Cas12a檢測靈敏度

將培養的副溶血性弧菌菌液進行10 倍梯度稀釋，同時取各稀釋度菌液1 mL提取基因組DNA，利用SRCACas12a方法對各稀釋度的基因組DNA進行檢測，確定方法的靈敏度。

1.3.8 SRCA-Cas12a特異性

使用細菌全基因組DNA提取試劑盒提取3 株副溶血性弧菌以及10 株非副溶血性弧菌的DNA。采用SRCACas12a方法進行檢測，同時以無酶無菌水作為空白對照，分析方法的特異性。

1.3.9 人工污染樣品中副溶血性弧菌的檢測

將培養的副溶血性弧菌菌液進行10 倍梯度稀釋，選擇適宜稀釋度進行平板計數，每個稀釋度3 個平行。分別取不含副溶血性弧菌的蝦肉樣品和牡蠣樣品5 g，接入不同稀釋度的副溶血性弧菌。將接種后的樣品加入45 mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水中混合均勻，取1 mL均質液提取DNA后使用SRCA-Cas12a方法進行檢測。

1.3.10 實際樣品檢測

從超市采集水產品36 份，樣品清單見表2。分別采用GB 4789.7ü2013《食品微生物學檢驗 副溶血性弧菌檢驗》方法以及SRCA-Cas12a方法進行檢測，驗證SRCACas12a方法在實際樣品檢測中的應用能力。分別根據式（1）～（3）確定敏感性、特異性和符合率：

表2 36 份實際樣品清單Table 2 List of 36 actual samples tested in this study

分別取25 g實際樣品加入225 mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水中混合均勻，按照GB 4789.7ü2013方法經增菌、選擇性分離、純培養及生化鑒定后判定結果。

取1 mL上述增菌液提取基因組DNA，所提取的基因組DNA作為SRCA-Cas12a方法的檢測模板，根據熒光信號判定所構建熒光傳感器的檢測結果。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 可行性驗證

根據實驗原理，可行性驗證主要分為SRCA擴增反應和剪切反應。

SRCA擴增產物為靶標序列和添加序列的串聯重復序列，所設計的SRCA目的序列長度為80 bp，如圖2a所示，SRCA擴增產物的凝膠電泳結果與反應原理一致。

Cas12a剪切反應的完整體系包括：Cas12a、crRNA、ssDNA報告分子以及靶標，只有當體系完整時才能檢測到熒光信號，因此設置各組分分別缺失的對照，即Cas12a＋crRNA＋靶標、Cas12a＋靶標＋ssDNA、Cas12a＋crRNA＋ssDNA、crRNA＋靶標＋ssDNA以及完整體系Cas12a＋crRNA＋靶標+ssDNA共5 組反應體系進行熒光檢測。如圖2b所示，只有在體系完整的情況下，才能形成Cas12a-crRNA-靶標三元復合物，從而觀察到較強的熒光信號。因此，SRCA擴增反應和Cas12a剪切反應的結果表明，所設計的SRCA-Cas12a方法可以用于副溶血性弧菌的檢測。

圖2 可行性驗證Fig.2 Feasibility verification

2.2 條件優化

探針是觀察熒光強度的關鍵因素，因此，本研究對ssDNA探針濃度進行優化，從而保證探針的使用效率。如圖3a所示，當ssDNA探針濃度從0.5 μmol/L增加到1.5 μmol/L時，/變化明顯；當ssDNA探針濃度從1.5 μmol/L增加到3.0 μmol/L時，/變化緩慢。因此，本研究選取1.5 μmol/L為探針的最優反應濃度。

反應時間的長短會影響檢測速率的快慢。如圖3b所示，當反應時間為5～15 min時，/逐漸增加；當反應時間為15～30 min時，反應進入平臺期。綜上，本研究選取15 min為最優反應時間。

在Cas12a剪切反應中，Cas12a-crRNA二元復合物形成量決定了剪切反應的速率。二元復合物形成量過少，影響剪切反應效率，不利于實驗進行；二元復合物形成量過多，增加實驗成本，造成不必要的浪費。如圖3c所示，當Cas12a與crRNA濃度比為1∶1時，/最大。綜合考慮，本研究中Cas12a/crRNA最優濃度比為1∶1。

圖3 反應條件優化Fig.3 Optimization of reaction conditions

2.3 線性范圍與檢出限結果

通過平板計數得出副溶血性弧菌初始菌液濃度為1.7h10CFU/mL。使用SRCA-Cas12a對不同稀釋度的副溶血性弧菌進行檢測，如圖4所示，熒光信號強度隨著菌液濃度的降低而降低。當副溶血性弧菌菌液濃度為1.7h10～1.7h10CFU/mL時，菌液濃度的對數與熒光信號強度變化（/）存在線性關系，線性方程為=1.847 2＋2.473 8（=0.986 6），線性關系良好，檢出限為3.6 CFU/mL（=3）。結果表明，SRCA-Cas12a可實現對副溶血性弧菌的定量檢測。

圖4 SRCA-Cas12a方法的靈敏度Fig.4 Sensitivity of SRCA-Cas12a

2.4 特異性實驗結果

為驗證SRCA-Cas12a檢測副溶血性弧菌的特異性，選取3 株副溶血性弧菌和10 株非副溶血性弧菌進行特異性實驗。如圖5所示，副溶血性弧菌產生的熒光信號強度明顯高于其他食源性致病菌產生的熒光強度。結果表明，所設計的crRNA可以特異性識別SRCA擴增產物，從而使Cas12a產生對ssDNA的非特異切割活性，ssDNA兩端的熒光基團和猝滅基團遠離，熒光強度增強。相反，其他食源性致病菌不能激活Cas12a的切割活性，熒光猝滅不會恢復。因此，SRCA-Cas12a該方法具有良好的特異性。

圖5 SRCA-Cas12a方法的特異性Fig.5 Specificity of SRCA-Cas12a

2.5 人工污染樣品中副溶血性弧菌的檢測

為驗證SRCA-Cas12a方法檢測的準確性，測定蝦肉和牡蠣空白樣品的加標回收率。由表3可知，人工污染樣品的加標回收率在95.5%～104.4%之間，相對標準偏差為1.7%～5.2%，表明該方法檢測結果準確可靠。

表3 人工污染樣品中副溶血性弧菌的檢測（n=5）Table 3 Results of determination of V.parahaemolyticus in artificially contaminated samples (n = 5)

2.6 實際樣品檢測結果

使用GB 4789.7ü2013方法以及SRCA-Cas12a方法分別對采集的36 份海產品進行檢測，并比較這2 種方法，檢測結果如表4所示。GB 4789.7ü2013方法陽性樣品檢出數為15 個，陰性樣品檢出數為21 個；SRCA-Cas12a方法陽性樣品檢出數為16 個，陰性樣品檢出數為20 個。以GB 4789.7ü2013方法檢測結果為標準，SRCA-Cas12a方法的敏感性為100.0%、特異性為95.2%、符合率達到97.2%。因此，SRCA-Cas12a方法在實際樣品檢測中有一定的應用能力。

表4 實際樣品檢測結果Table 4 Results of detection of actual samples by SRCA-Cas12a and conventional culture method

3 討 論

將SRCA擴增反應與CRISPR/Cas12a系統相結合，建立了一種檢測海產品中副溶血性弧菌的新方法。SRCA作為一種新型核酸等溫擴增技術，可對靶標序列快速擴增實現信號放大，同時也可作為對靶標序列的第1重識別。CRISPR/Cas12a系統中crRNA通過PAM序列與SRCA擴增產物中大量重復的靶標序列結合，從而對靶標序列二次識別，激活Cas12a的非特異切割活性。研究表明Cas12a的切割速率達到250 次/s。因此，將CRISPR/Cas12a系統與SRCA結合提高了檢測的靈敏度和特異性。該方法對副溶血性弧菌的線性檢測范圍為1.7h10～1.7h10CFU/mL，檢出限為3.6 CFU/mL。對3 株副溶血性弧菌和10 株非副溶血性弧菌進行特異性實驗的結果表明，該方法具有良好的特異性。利用SRCA-Cas12a方法進行加標回收率實驗，樣品的加標回收率在95.5%～104.4%之間。使用GB 4789.7ü2013方法以及SRCA-Cas12a方法分別對采集的36 份海產品進行檢測，結果可得SRCA-Cas12a方法的敏感性為100.0%、特異性為95.2%、符合率為97.2%。此外，由于CRISPR/Cas12a系統的可編程性，該檢測方法可針對不同靶標分子設計引物和crRNA，從而實現對其他食源性致病菌的檢測。并且該方法在現場檢測時可以選擇小型的熒光觀察裝置，通過肉眼觀察結果。同時，在今后研究中探索基于SRCA-Cas12a方法的多重核酸檢測方法，有望使CRISPR/Cas系統在多重核酸檢測領域得到應用。

綜上所述，SRCA-Cas12a方法具有靈敏度高、特異性強的優點，為副溶血性弧菌的快速定量檢測提供了一種新策略，也為其他食源性致病菌的檢測提供新思路，對保障食品安全具有重要的現實意義和參考價值。