分子印跡光子晶體傳感器的制備及其對酒類食品中鄰苯二甲酸二丁酯的快速檢測

張 鑫，馬藝涵，崔雨桐，毛嘉悅，姚云劍

（1.南陽師范學院生命科學與農業工程學院，河南 南陽 473061；2.農業生物質資源化河南省高校工程技術研究中心，河南 南陽 473061）

食品以及食品包裝的有害物質檢測已經成為食品安全管理的重要部分。鄰苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）是一種環境內分泌干擾物，在工業上廣泛用作塑化劑，可以通過食品包裝材料接觸、土壤-水-土壤之間等多種途徑遷移進入人體和環境地表水中，給人類和自然環境帶來極大的危害。近些年，我國塑化劑含量超標引發的食品安全問題屢次發生。如2011年中國臺灣地區曝出“起云劑”事件，某知名白酒被報道產品中DBP嚴重超標，引發社會對食品安全的極大關注。目前，已經有多種技術手段用于鄰苯二甲酸酯類塑化劑的檢測，如高效液相色譜法、氣相色譜法、質譜、液相色譜-質譜、電化學法、化學/生物傳感器等。然而，這些方法雖然可以準確測定目標分析物的含量，但是要求精密儀器設備以及專業技術人員，并不適合現場的快速篩查分析以及消費者使用。因此，開發一種操作簡單、成本低廉的塑化劑檢測方法極其必要。

光子晶體是由介電常數（折射率）不同的材料按固定周期順序排列而形成的晶體結構。利用光子晶體凝膠體積收縮或膨脹的變化引起的晶格參數和介電常數的變化，可以設計體積小、易合成、靈敏度高的新型傳感器元件。當光子晶體的結構參數發生變化，可以通過其衍射峰位移或者峰強度的變化表達其對目標分析物的響應。在一定條件下，還可以通過光子晶體的結構色變化，實現裸眼判別對目標分析物。分子印跡技術是指構建對模板分子在大小、形狀、以及功能基團互補的受體的一種技術。在洗脫模板分子后，制備得到與模板分子具有互補結合位點的分子印跡聚合物，具有選擇性高、成本低廉以及機械性高的優點。Zhou Zhipin等制備了基于二氧化硅包覆的錳摻雜的硫化鋅量子點熒光分子印跡傳感器，成功用于自來水中DBP的檢測，其檢測限為0.04 μmol/L。李穎等制備了金修飾的磁性石墨烯分子印跡聚合物膜，用于水中DBP的分析檢測，對DBP的相應時間為6 min，檢出限為0.349 nmol/L。Chen Shan等采用溶膠-凝膠聚合方法制備了基于CdTe量子點和咪唑酸沸石骨架-67的近紅外熒光分子印跡傳感器，用于食品中DBP的高選擇性、高靈敏檢測。Wang Shan等采用表面分子印跡技術，以羧基化的二氧化硅微載體制備了DBP的分子印跡電化學傳感器，并通過多壁碳納米管和金納米粒子改善了探針的選擇性，為復雜樣品中的DBP檢測提供一種有效地電化學檢測方法。這些研究表明分子印跡技術在DBP檢測中具有很好的應用前景，而將分子印跡技術與光子晶體技術結合，可以構建DBP分子印跡光子晶體傳感器。相比于其他DBP的檢測方法，分子印跡光子晶體傳感器利用分子印跡的高選擇性捕獲樣品中的DBP分子，同時將DBP的分子識別轉換為光學信號，響應時間快，操作更簡單，選擇性高，是一種理想的DBP的檢測方法。

基于此，本研究將光子晶體的光學特性與分子印跡的選擇性結合，以鄰苯二甲酸二丁酯為模板分子，構建具有反蛋白石結構的分子印跡光子晶體凝膠膜（molecularly imprinted photonic hydrogels，MIPHs）用于DBP的快速識別分析。本方法不僅保留了分子印跡的高選擇性也改變傳統的MIPs傳質慢、洗脫難等問題，同時也拓寬了光子晶體的應用范圍。制備的DBP分子印跡光子晶體傳感器成本低、操作簡單方便，可以多次重復使用，通過簡單洗脫即可連續化操作，有利于現場實時在線檢測酒類中的微量DBP分子，具有廣闊的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

二甲基丙烯酸乙二醇酯（ethyleneglycol dimethacrylate，EGDMA）、甲基丙烯酸（methacrylic acid，MAA） 北京百靈威科技有限公司；正硅酸乙酯（tetraethoxysilane，TEOS）、偶氮二異丁腈（azobisisobutyronitrile，AIBN）、DBP、鄰苯二甲酸（phthalic acid，PA）、鄰苯二甲酸二甲酯（dimethyl phthalate，DP）、鄰氨基苯甲酸甲酯（methyl anthranilate，MA） 上海麥克林生化科技有限公司；濃硫酸（純度為98%）、氫氟酸（hydrofluoric acid，HF，40%） 洛陽昊華化學試劑有限公司；甲醇、無水乙醇、乙酸（純度均為99%） 天津市科密歐化學試劑有限公司。以上試劑均為分析純，實驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

SB-5200超聲波清洗儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；SPECORD高精密紫外分光光度計 德國耶拿儀器有限公司；101恒溫鼓風干燥器 北京中興偉業儀器有限公司；Sigma 500/VP場發射掃描電鏡 德國卡爾蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 單分散SiO微球的合成

單分散二氧化硅微球的制備過程如下：首先，將10 mL濃氨水（28%）、16.25 mL乙醇以及24.75 mL水依次加入到燒杯中1 200 r/min攪拌；其次，4.5 mL TEOS和45.5 mL無水乙醇快速加入，混合均勻后，室溫下360 r/min反應2 h；最后，離心收集后乙醇清洗3 次除去未反應物，保存備用。

1.3.2 DBP分子印跡光子晶體凝膠膜的制備

將硅片清洗后裁剪為76 mmh12 mm，置入HSO-HO（9∶1，/）中浸泡24 h，然后純水清洗，氮氣吹干備用。定制厚度為1 mm的25 mmh10 mm的聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）膜片備用。篩選粒徑為240 nm單分散二氧化硅微球，采用垂直自組裝法制備光子晶體模板。反蛋白石結構的分子印跡光子晶體凝膠膜制備參考相關文獻方法并作一定改進。過程如圖1所示，首先，將模板分子（DBP，0.1 g）和功能單體（MAA，0.50 mL）溶于2.0 mL無水甲醇中，超聲分散后加入交聯劑（EDGMA，0.58 mL），混勻后加入2.7 mg AIBN得到預聚合溶液；其次，采用后填充技術，將上述溶液緩慢注入光子晶體與PMMA間的縫隙，同時固定兩側給予壓力，保證MIPHs的成型，將硅片置于波長365 nm紫外光下引發聚合3 h后靜置反應12 h；最后，待聚合反應完成后，將上述硅片浸入2.5%氫氟酸溶液中刻蝕去除光子晶體模板，即得到反蛋白石結構的MIPHs。構建的DBP分子印跡光子晶體膜用甲醇-乙酸（9∶1，/）洗脫劑去除模板分子，作為對照，非印跡光子晶體聚合物膜（non-imprinted photonic hydrogels，NIPHs）除不加入模板分子外，其余制備步驟一致。

圖1 分子印跡光子晶體凝膠膜的制備示意圖Fig.1 Schematic of preparation of MIPHs

1.3.3 DBP分子印跡光子晶體膜制備條件優化

為了能夠順利引發聚合，同時保證下一步刻蝕時聚合膜的完整性，分別改變了MAA、EGDMA和AIBN的用量，探究制備MIPHs的最優條件。具體過程如下：固定模板DBP用量，考察不同功能單體MAA和交聯劑EGDMA用量比例對制備的MIPH的性能影響。在進行模板的刻蝕時，為了保證能夠完全刻蝕除去二氧化硅微球，留下完整的反蛋白石結構空穴，實驗考察不同質量分數的氫氟酸（1.0%、2.5%、3.0%、4.0%、5.0%）以及刻蝕時間對制備過程的影響。選用不同洗脫溶劑，篩選最佳洗脫條件。

1.3.4 制備的DBP分子印跡光子晶體膜性能測定

分別將制備的DBP分子印跡光子晶體膜和非印跡膜置入0.1 mg/L的DBP溶液中，測定不同時間下光譜變化，記錄峰位移量與時間的變化曲線。將制備的MIPHs和NIPHs分別置入10 mL不同質量濃度（0.01～0.5 mg/L）的DBP溶液中，25 ℃反應3 min，測定其對DBP的吸附量變化。MIPHs和NIPHs對DBP吸附量（，mg/g）按式（1）計算：

式中：和分別為初始和吸附平衡時樣品中DBP的質量濃度/（mg/mL）；為樣品溶液的體積/mL；為MIPHs和NIPHs的質量/g。

1.3.5 選擇性實驗

選用PA、MA作為DBP的結構類似物進行選擇性實驗。將制備的MIPHs和NIPHs分別置入一系列質量濃度（0.01～0.5 mg/L）的樣品溶液中，測定其衍射峰位移變化。

1.3.6 實際樣品分析

將制備的MIPHs傳感器用于實際樣品中DBP檢測分析。實際樣品選用超市售白酒，樣品經濾膜（0.45 μm）過濾后，將制備的MIPHs置入不同樣品后測定其光譜變化，記錄峰位移量。為了進一步評價傳感器的檢測性能，實驗采用標準加入法在實際樣品中加入DBP標準品，測定加標前后MIPHs的峰位移量變化。

2 結果與分析

2.1 DBP分子印跡光子晶體凝膠膜的制備

采用掃描電子顯微鏡對制備的光子晶體模板和分子印跡光子晶體凝膠膜進行形態與結構分析，結果如圖2所示。制備光子晶體模板電鏡圖顯示光子晶體模板上的二氧化硅微球緊密排列，SiO微球之間有序排列，為后續分子印跡聚合物的填充提供了充分條件。制備光子晶體模板的最大衍射峰波長應位于480 nm左右。實驗結果表明，制備的光子晶體膜的特征峰為486 nm，呈青綠色，符合理論計算結果。

MIPPHs的制備是將預聚合溶液在毛細管壓力的作用下均勻充滿光子晶體模板孔隙聚合，然后采用HF溶液刻蝕去除模板，得到反蛋白石結構分子印跡光子晶體凝膠膜。由圖2B可知，成功刻蝕去除光子晶體模板后，得到由分子印跡聚合物構成支撐的反蛋白石多孔網狀結構，制備的MIPHs空穴均一，直徑約為220 nm左右，呈多層有序排列。制備MIPPHs洗脫去除模板分子（DBP）后，即可形成與DBP分子在功能基團、大小、形狀上互補的印跡空穴，特異結合DBP分子，從而改變MIPPHs膜上孔穴結構變化，導致MIPPHs的衍射峰位移發生變化，利用這一點可以實現對樣品中DBP分子特異識別檢測。

圖2 光子晶體模板（A）和反蛋白石結構分子印跡凝膠膜（B）的掃描電鏡圖Fig.2 SEM images of photonic crystal templates (A) and molecularly imprinted inverse opal photonic hydrogels (B)

2.2 MIPPHs制備條件的優化

實驗進一步對MPPHs的制備體系進行優化，結果如圖3所示。實驗結果表明，在DBP用量一定的條件下，當功能單體MAA與交聯劑EGDMA 的物質的量比為2∶1時，制備的MIPPHs對DBP具有光譜響應最明顯。此外，刻蝕效果直接影響制備的MIPHs上的孔穴結構，實驗對光子晶體模板刻蝕條件進行考察。當溶液中HF質量分數較低時，會導致刻蝕不完全，而過高的HF質量分數會造成PMMA快速脫落，MIPHs膜分布不均。最終實驗確定最佳刻蝕條件為質量分數2.5% HF溶液滴加刻蝕3.0 h效果最好。在進行膜上模板分子洗脫時，甲醇和乙酸能夠破壞化學鍵的極性，使氫鍵斷裂，模板DBP分子溶于甲醇中，留下空穴和特異性識別位點再次結合模板分子。因此，實驗選擇不同洗脫體系進行模板分子的洗脫體系：甲醇-乙酸、甲醇-水-乙酸、乙酸溶液，考察MIPHs在不同洗脫體系下模板分子的洗脫效果。當選用不同體積分數、不同物質構建洗脫體系時，分子印跡膜與模板分子的洗脫效果有顯著差異，最終采用甲醇-乙酸（9∶1，/）作為洗脫溶劑。

圖3 功能單體（MAA）與交聯劑（EGDMA）用量比例對MIPHs峰位移的影響Fig.3 Effect of ratio between MAA and EGDMA on diffraction peak displacement of MIPHs

2.3 MIPPH對DBP的吸附性能

2.3.1 吸附動力學

將制備的MIPHs置入0.1 mg/L DBP溶液中，測定其隨時間的特征峰位移量變化，結果如圖4所示。由圖4可知，在最初0～3 min內，MIPPHs的特征峰位移量迅速增大，在吸附反應3 min后，MIPPHs的特征峰位移量趨于穩定，表明對DBP的吸附達到平衡。結果表明，制備的MIPPHs能夠對DBP分子具有快速響應能力，在3 min時即可達到DBP的吸附平衡。

圖4 反應時間對制備MIPHs和NIPHs衍射峰位移的影響Fig.4 Effect of reaction time on diffraction peak displacement of MIPHs and NIPHs

2.3.2 吸附等溫線

測定制備的MIPPHs對DBP的吸附等溫線，評價MIPPHs對DBP的吸附性能。由圖5A可知，MIPPH對DBP吸附量隨著樣品溶液中DBP濃度的升高而增加，且MIPPHs對DBP的吸附量明顯高于NIPPHs。這是由于MIPPHs上存在3D-印跡空穴，更易于DBP分子進入膜內，特異吸附結合DBP分子，表現出對DBP較高的吸附量。相反，NIPPHs上沒有印跡位點，通過非特異性吸附結合DBP分子。采用Scatchard方程對分子印跡光子晶體對DBP的吸附數據進行擬合分析，Scatchard方程如下：

式中：為平衡時MIP對DBP的結合量/（mg/g）；為平衡時游離DBP的質量濃度/（mg/L）；為MIP對DBP的最大結合量/（mg/g）；為平衡時的解離常數。

由圖5B可知，Scatchard分析結果得到2 條不同斜率的直線，表明制備的分子印跡光子晶體對DBP具有2 種結合位點，其擬合方程分別為/＝5.10－0.052 3（＝0.980 3）和/＝2.021 0－0.345 0（＝0.980 7）。

圖5 MIPHs對DBP吸附平衡等溫線（A）和 Scatchard擬合分析（B）Fig.5 Adsorption isotherms (A) and Scatchard fitting curves (B) of MIPHs for DBP

2.4 MIPPHs對DBP的傳感分析

由圖6可知，當與溶液中DBP分子結合后，制備MIPHs發生明顯紅移，波長移動到535 nm，而未結合DBP分子時，衍射峰位于503 nm，位移大小為32 nm，這主要是因為制備的MIPPHs上存在DBP分子印跡空穴，可以選擇性捕獲溶液中的DBP分子，DBP吸附結合量大，在非共價作用力的作用下結構發生改變，形成明顯位移變化。而當洗脫去除膜上結合的DBP后，其衍射峰又恢復到500 nm左右。作為對照，NIPPHs衍射峰的位移不明顯，DBP分子結合量小，其位移變化不依賴于DBP質量濃度。因此，根據這一變化，實驗可以通過對分子印跡膜的衍射峰變化判斷樣品中DBP分子的存在。如圖7所示，將制備的MIPHs置于不同質量濃度的DBP樣品中，在反應一段時間后，MIPPHs衍射峰發生紅移，其位移與DBP的質量濃度呈正比例關系，由此可以擬合方程計算溶液中DBP的質量濃度。當DBP質量濃度為0.01～0.50 mg/L時，MIPHs的衍射峰發生明顯位移，表明MIPPHs可以很好測定樣品中DBP分子的存在和含量。在DBP質量濃度為0.01～0.10 mg/L范圍內，MIPHs的位移量與DBP質量濃度呈良好的線性關系（＝0.992 0），MIPHs對DBP的檢出限為0.01 mg/L（＝3），低于國家標準中DBP的檢測標準（0.3 mg/kg）。實驗結果表明，當樣品溶液中存在DBP時，制備的MIPPHs在短時間即可與樣品中DBP分子結合從而發生位移變化，達到快速定性檢測樣品中是否存在DBP的目的。

圖6 MIPHs（A）和NIPHs（B）在不同質量濃度的DBP溶液中的光譜變化Fig.6 Spectral changes of MIPHs (A) and NIPHs (B) in DBP solutions at different concentrations

圖7 MIPHs和NIPHs在不同質量濃度的DBP溶液中的衍射峰位移變化及線性回歸曲線Fig.7 Change in diffraction peak displacement and linear regression curves of MIPHs and NIPHs in DBP solutions at different concentrations

2.5 選擇性實驗

實驗選用MA和PA作為DBP結構類似物，考察制備的MIPHs對DBP選擇性。由圖8可知，在不同樣品溶液中孵育反應一段時間后，MIPHs在DBP樣品溶液中的衍射峰位移量明顯高于MA和PA，表明MIPHs對DBP具有明顯的選擇性結合能力。作為對照，NIPHs在DBP和3 種結構類似物溶液中的衍射峰位移量變化不明顯，進一步證明了分子印跡光子晶體聚合物膜對DBP的特異選擇性。

圖8 MIPHs和NIPHs在DBP、MA、PA溶液中的衍射峰位移變化Fig.8 Changes in diffraction peak displacement of MIPHs and NIPHs in DBP, MA and PA solutions

2.6 重復利用率

實驗對制備的MIPPHs穩定性和重復利用率進行測定。如圖9所示，制備的MIPPHs在經過5 次吸附-洗脫-吸附循環后，仍具有良好的光學性能，其最大特征峰與最初未結合DBP時接近，說明制備的高度交聯的網狀凝膠聚合物MIPPHs物理化學穩定性高，可以多次重復利用。

圖9 MIPHs的重復利用率Fig.9 Recyclability of MIPHs

2.7 實際應用能力

考察制備的MIPHs對DBP檢測的實際性能。由表1可知，將MIPHs分別置于添加不同含量的DBP白酒樣品中，對添加DBP的白酒樣品進行回收率測定，其加標回收率為95.60%～103.20%之間，表明MIPHs對DBP檢測具有良好的可靠性，具備對酒類中DBP檢測的實際應用潛力。

表1 MIPHs對白酒中DBP的檢測Table 1 Results of detection of DBP in baijiu samples using MIPHs

3 結 論

開發設計基于反蛋白石結構的MIPHs傳感器，實現樣品中DBP的快速識別分析。實驗制備MIPPHs的位移量變化與DBP質量濃度具有良好的線性關系，并成功用于白酒樣品中DBP的檢測，具有成本低、響應快、高選擇性以及可靠性的優點。此外，本方法開發的MIPPHs傳感器在對于食品安全領域有極大的應用潛力，可以推廣到其他有害物質的快速檢測，在現場實時檢測，公眾的健康保障以及食品衛生安全等領域具有積極的社會意義和實際價值。