高通量測序技術分析西藏不同海拔地區曲拉微生物多樣性

薛 蓓，盧灝澤,，楊 帆,，張洋銘，羅 章，張鳳杰，薛 潔,*

（1.西藏農牧學院食品科學學院，西藏 林芝 860000；2.中國食品發酵工業研究院，北京 100015）

曲拉，藏語意為干奶渣，是西藏地區牧民家庭自制的一種奶酪制品，其營養豐富，便于貯藏，具有獨特的口感與特殊的風味。曲拉帶有濃重的地域特色，已逐漸成為青藏高原上的特色農產品。曲拉的制作工藝基本如下：將牦牛乳煮沸脫脂后，接種酸乳清，在自然條件下發酵，排出乳清后自然風干而成。在自然發酵條件下，由于生產環境的差異，會造成成品曲拉中微生物菌群組成的差異。導致成品曲拉品質不穩定，安全性也不能保證。

張蓓利用傳統培養方法，對不同制作階段的曲拉進行分析，發現酵母菌和乳酸菌是整個發酵過程中的優勢微生物。卿蔓君等將曲拉中的微生物進行分離純化，優勢菌屬為畢赤酵母屬（）、克魯維酵母屬（）。文鵬程等從牦牛曲拉中分離出性能較好、不同菌屬的乳酸菌。由于傳統培養方法費時費力、部分微生物難以培養、操作復雜易出錯等缺點，不能完整地表現出曲拉中微生物的多樣性。已有研究對采自中國不同地區的多個傳統發酵乳樣品的分析結果表明，不同樣品中的微生物多樣性與地理環境密切相關，不同地區的發酵乳制品中微生物群落結構不同，且存在明顯的差異。

曲拉自然發酵的生產過程決定了其風味與微生物組成有很大關系，由于不同地域的微生物組成不同，可能對曲拉在發酵過程中產生的風味造成影響。研究曲拉微生物多樣性，對探明其群落結構以清晰了解不同微生物在曲拉中的分布情況、鑒別有無致病菌保證曲拉安全性有重要意義。此外，可以發掘曲拉中的高原特色微生物，對優良菌種進行開發利用，豐富菌種資源。本研究利用高通量測序技術，分析西藏不同海拔地區曲拉中微生物的群落結構，以期探明不同海拔地區曲拉中微生物差異情況，并為曲拉中微生物的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采集自西藏不同海拔地區的40 份牦牛曲拉（牦牛品種為西藏高山牦牛，年齡在5～6 歲，該品種在西藏數量多，分布廣，適應性強，是西藏牦牛的重要代表），采于2021年3月，樣品信息見表1。

表1 樣品名稱及分組信息Table 1 Coding and grouping of Qula samples from different altitudes

E.Z.N.A.Soil DNA試劑盒 美國Omega BioTek公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）所用試劑 大連寶生生物公司。

1.2 儀器與設備

PCR儀、凝膠成像系統 美國伯樂公司；臺式離心機湖南恒諾儀器公司；電泳儀 北京六一儀器廠；高通量測序儀 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集與分組

按照表1所示采樣地點，采集曲拉樣品，將樣品放置于無菌采樣袋中，冰袋低溫下保存，盡快送回實驗室，4 ℃保存備用。根據樣品采樣地點海拔高度，將所有樣品分為3 組：低海拔組當地海拔高度為3 000 m以下；中海拔組當地海拔高度在3 000～4 000 m；高海拔組當地海拔高度為4 000 m以上。

1.3.2 DNA提取

樣品的總DNA提取利用試劑盒，按照試劑盒內的使用說明進行具體操作。

1.3.3 PCR擴增

PCR體系：10hPCR buffer（Mgplus）2.5 μL，dNTP Mixture 2.0 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，DNA模板1.0 μL，rDNA聚合酶（5 U/μL）0.3 μL，ddHO 17.2 μL。

細菌V3-V4區域的通用引物為338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）、806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）。PCR擴增條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，擴增30 個循環；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

真菌ITS區域的通用引物為ITS1F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）、ITS2R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）。PCR擴增條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，擴增35 個循環；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.4 高通量測序

將PCR產物送至美吉生物公司，后續的文庫構建與上機測序由該公司的Illumina MiSeq PE300測序平臺進行。

1.4 數據處理

使用Trimmomatic軟件對原始序列進行質控與過濾，舍去質量較低的序列，用FLASH軟件對原始序列進行拼接，使用UCHIME軟件剔除嵌合體。使用UPARSE軟件，根據97%相似性對序列進行可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類。將所有優化序列map至OTU代表序列，選出與OTU代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格，在美吉生物云平臺進行數據分析。根據多樣性指數，分析不同組樣品的多樣性。根據OTU數量的Venn圖，分析不同組樣品含有的OTU數量，根據樣品在屬水平下的物種相對豐度圖，分析不同組樣品的優勢微生物與群落結構，根據主成分分析（principal component analysis，PCA）與非加權組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）層級聚類分析不同組樣品間差異情況。

2 結果與分析

2.1 不同曲拉樣品中微生物α多樣性分析

多樣性可反映出不同樣品間物種多樣性與豐富度的差別，本研究對3 組曲拉樣品中微生物的多樣性進行分析，結果如表2、圖1所示。可得低海拔組與中海拔組、高海拔組樣品的細菌多樣性指數與豐富度指數都存在顯著差異（＜0.05），中海拔組與高海拔組差異不顯著。隨著海拔高度的上升，曲拉樣品中細菌的多樣性指數與豐富度指數都呈下降趨勢。造成該現象的原因可能是隨著海拔高度的上升，溫度逐漸降低、降水逐漸減少、大氣壓降低。這些環境因素的改變對微生物會造成較大影響，導致對不良環境耐受性較差的微生物不能生長。

表2 曲拉樣品中細菌測序數據統計Table 2 Statistics of bacterial sequencing data of Qula samples

圖1 細菌Shannon指數（a）和Chao1指數（b）箱式圖Fig.1 Bacterial Shannon index (a) and Chao1 index (b)

結合表3、圖2可得，3 組樣品間真菌多樣性指數差異不顯著，但低海拔組與中海拔組、高海拔組樣品的真菌豐富度指數存在顯著差異（＜0.05），中海拔組與高海拔組差異不顯著。與細菌相比，真菌對不良環境的耐受性更強，因此海拔變化對真菌的影響較細菌小。但隨著海拔高度的上升，各種環境因素的改變導致了微生物生長條件變差，中海拔組與高海拔組的微生物多樣性都比低海拔組要低。

表3 曲拉樣品中真菌測序數據統計Table 3 Sequencing data statistics of fungi in Qula samples

圖2 真菌Shannon指數（a）和Chao1指數（b）箱式圖Fig.2 Fungal Shannon index (a) and Chao1 index (b)

2.2 樣品所含OTU數量分析

為了研究不同海拔地區的曲拉樣品中微生物多樣性，需要對不同組樣品的序列按97%的一致性聚類為OTU，然后進行分析。通過聚類操作，按照RDP貝葉斯算法分析不同水平中OTU代表序列，利用R軟件，繪制Venn圖。

由圖3可知，低海拔組含有細菌OTU 2 411 個、中海拔組含有細菌OTU 1 391 個、高海拔組含有細菌OTU 1 197 個，其中低海拔組與中海拔組共有的細菌OTU 473 個、低海拔組與高海拔組共有的細菌OTU 217 個、中海拔組與高海拔組共有的細菌OTU 75 個，3 組共有的細菌OTU 715 個。低海拔組含有細菌OTU數量最多、中海拔組次之、高海拔組最少。

圖3 曲拉樣品細菌群落Venn圖Fig.3 Venn diagram showing shared and unique bacterial OTUs among Qula samples

由圖4可知，低海拔組含有真菌OTU 801 個、中海拔組含有真菌OTU 343 個、高海拔組含有真菌OTU 399 個，其中低海拔組與中海拔組共有的真菌OTU 64 個、低海拔組與高海拔組共有的真菌OTU 75 個、中海拔組與高海拔組共有的真菌OTU 17 個，3 組共有的真菌OTU 173 個。低海拔組含有真菌OTU數量最多、高海拔組次之、中海拔組最少。

圖4 曲拉樣品真菌群落Venn圖Fig.4 Venn diagram showing shared and unique fungal OTUs among Qula samples

2.3 不同樣品在屬水平的比較

在樣品中檢出的眾多微生物中，由于許多物種含量過少，不具有代表意義。因此在群落組成分析中，將相對豐度小于1%的物種歸為其他類（others），相對豐度大于1%的物種按豐度大小進行繪圖。

由圖5所示，共檢出23 種相對豐度大于1%的屬，隨著海拔高度的上升，樣品中優勢微生物的種類減少。其中低海拔組17 種，中海拔組11 種，高海拔組7 種。不同組樣品共有的優勢屬為乳球菌屬（）、乳桿菌屬（），平均相對豐度為34.0%和18.4%。在低海拔組中，優勢菌屬為紅球菌屬（）13.1%、12.2%、考克氏菌屬（）9.5%、6.4%、醋酸菌屬（）5.9%。中海拔組中，優勢菌屬為54.6%、12.8%、10.4%。在高海拔組中，優勢菌屬為40.9%、30.2%、9.4%。除低海拔組外，和在樣品中占有絕對優勢。在各組樣品中，明串珠菌屬（）、片球菌屬（）、腸球菌屬（）、鏈球菌屬（）、魏斯氏菌屬（）、雙歧桿菌屬（）也有較高的豐度，這些乳酸菌也常見于各種發酵乳制品、泡菜等傳統發酵食品，在生產過程中代謝產生乳酸、促進發酵，抑制有害菌，并產生各種風味物質，最終使傳統發酵食品具有其典型的特征。

圖5 曲拉樣品在屬水平的細菌群落組成Fig.5 Bacterial community composition of Qula samples at the genus level

如圖6所示，共檢出23 種相對豐度大于1%的屬，其中低海拔組11 種，中海拔組12 種，高海拔組13 種。不同組樣品間優勢微生物的種數差異不明顯。不同組樣品共有的優勢屬為地霉屬（），平均相對豐度為33.8%。白地霉（）是奶酪中常見的真菌，在發酵過程中產生揮發性物質，影響奶酪的風味。在低海拔組中，優勢菌屬為曲霉屬（）21.1%、20.0%、青霉屬（）16.7%。在中海拔組中，優勢菌屬為48.0%、畢赤酵母屬（）8.15%。在高海拔組中，優勢菌屬為33.6%、7.4%。在各組樣品中，克魯維酵母屬（）、、假絲酵母屬（）也有較高的豐度，這些酵母菌常見于各種奶酪制品中，對奶酪的風味產生重要影響。此外，未鑒定出的屬在不同組樣品中也有較高的豐度。

圖6 曲拉樣品在屬水平的真菌群落組成Fig.6 Fungal community composition of Qula samples at the genus level

2.4 不同曲拉樣品中微生物β多樣性分析

利用SPSS軟件，分析曲拉樣品的細菌、真菌群落。由圖7a可得出，低海拔組樣品在PCA圖中的位置集中，距離緊密，樣品間相似度較高，有明顯的聚類趨勢。中海拔組樣品在PCA圖中的位置比較集中，距離接近，高海拔組的樣品在PCA圖中較為分散，距離較遠。圖7b為基于unweighted_unifrac距離的UPGMA聚類分析圖，低海拔組的樣品聚類較為集中，樹枝間的長度較短，樣品間相似度較高，且與中海拔組、高海拔組的距離較遠。中海拔組、高海拔組的樣品樹枝間長度較長，樣品間相似度較低。與PCA所得出的結論一致。

圖7 不同組樣品的細菌群落PCA（a）與層級聚類分析（b）Fig.7 PCA plot for bacterial communities in samples from different groups (a) and hierarchical cluster analysis (b)

由圖8a可見，低海拔組樣品在PCA圖中的位置分散，距離較遠，樣品間相似度較低，中海拔組、高海拔組的樣品在PCA圖中位置集中，距離較近，樣品間相似度較高。圖8b中，低海拔組樣品樹枝間的長度較長，樣品間相似度較低，與中海拔組、高海拔組差異較大。中海拔組、高海拔組的聚類較為集中，樹枝間的長度較短，樣品間相似度較高。與PCA所得出的結論一致。

圖8 不同組樣品的真菌群落PCA（a）與層級聚類分析（b）Fig.8 PCA plot for fungal communities in samples from different groups (a) and hierarchical cluster analysis (b)

3 討 論

曲拉作為我國傳統發酵食品，屬于酸凝型奶酪，往往在自然條件下經過多菌種的共同發酵制成。曲拉中微生物群落結構對曲拉的風味影響重大：乳酸菌是曲拉中細菌的核心菌群，在曲拉生產過程中，乳酸菌代謝產生乳酸促進凝乳、生成多種風味物質。多種乳酸菌協同發酵可減少發酵時間，提高生產效率，改善曲拉的整體品質。酵母菌則與蛋白質水解、脂類降解等代謝途徑密切相關，改善曲拉的質地與風味。一些霉菌也對曲拉的品質有重要影響。但曲拉在自然粗獷的生產條件下，多微共酵的發酵方式有可能使致病菌生長繁殖，導致其安全性受到嚴重影響。因此，探明發酵過程中的部分關鍵微生物，對改進曲拉生產工藝、促進風味物質產生、保證曲拉安全性等有重要意義。

自然發酵乳制品有很高的微生物多樣性，是由其發酵環境決定。本研究中，和為不同組樣品共有的優勢菌群，這與曹磊、劉振東等對不同產地牦牛曲拉的細菌群落結構進行比較，發現、為優勢菌屬的結論一致。Wafa等在對丹麥生產的奶酪的細菌多樣性分析中發現，和均為奶酪中的優勢菌屬。Quigley等研究發現在愛爾蘭奶酪中是優勢菌屬。乳酸菌按照其在乳制品中的作用，又可分為發酵劑乳酸菌和非發酵劑乳酸菌，發酵劑乳酸菌在牛乳中產酸速率高，促進凝乳。非發酵劑乳酸菌在奶酪生產過程中產酸作用弱或不產酸，主要起加快奶酪成熟、改善奶酪風味的作用。一些嗜溫型乳酸菌如、等在奶酪成熟過程中作為產香菌，可加快成熟過程并產生風味物質，對奶酪的整體風味起修飾作用。乳酸菌在各種發酵乳制品中，所占比例均較大，在整個生產發酵過程中，對成品的質量與風味都起到了重要作用。李先勝等對采自西藏牧民家庭的曲拉進行分離純化，篩選出的優勢酵母菌為馬克斯克魯維酵母（s），該菌同樣為青海酸牦牛奶中的優勢菌群。馬龍等發現、、是天然開菲爾粒中的優勢酵母，這些酵母菌也廣泛存在于各種奶酪中，在發酵過程中產生揮發性風味物質，影響著奶酪的風味。曲拉的自然發酵是一個復雜的過程，其中包括各種乳酸菌與酵母菌的共同作用，各種菌群間的協同或抑制作用廣泛存在，造成曲拉的風味受到較大影響，如果發酵時的衛生條件較差，還有可能感染各種致病菌，導致其安全性下降。由于發酵過程受環境影響較大，不同批次的產品品質波動較大。自然發酵的乳制品具地方特色，深受當地群眾喜愛，有較大的改進空間與市場前景。因此，對于自然發酵乳制品中的各種微生物的作用還需深入研究。

4 結 論

利用高通量測序技術，對西藏不同海拔地區的40 份曲拉樣品的微生物群落結構進行分析。研究表明，不同海拔地區的曲拉樣品中微生物群落結構有所差異。低海拔地區的曲拉樣品中微生物多樣性較高，中海拔地區的曲拉樣品中微生物多樣性較低，高海拔地區的曲拉樣品中的微生物多樣性最低。隨著海拔高度上升，曲拉樣品中的微生物多樣性下降。