傳統發酵豆醬中嗜鹽四聯球菌的分離鑒定及增鮮菌株篩選

潘國楊，安飛宇，曹愷欣，劉進昌，趙 越，趙 悅，徐菁雯，王雨生，馬媛媛，武俊瑞，烏日娜,*

（1.沈陽農業大學食品學院，遼寧省食品發酵技術工程研究中心，沈陽市微生物發酵技術創新重點實驗室，遼寧 沈陽 110866；2.煙臺欣和企業食品有限公司，山東 煙臺 264006）

作為傳統調味品，豆醬因其具有的獨特的鮮味，至今仍深受大眾青睞。鮮味能使人產生舒服愉快的感覺，是人體必不可少的味覺需求。1978年，Yamasaki等首次從木瓜蛋白酶降解的牛肉水解物中分離純化得到一種氨基酸序列為Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala的辛肽，將其命名為鮮味肽，近年來，在許多肉類、豆類、水產品等食物中分離出多種新型鮮味肽。Han Fuliang等在黃酒中發現了一種僅由Glu組成且具有鮮味的三肽，Su Guowan等從花生中提取到一種鮮味增強肽。有研究發現嗜鹽四聯球菌（）廣泛存在于豆醬、豆豉、醬油、等發酵食品中，具有提升發酵食品風味、改善發酵食品品質的功能。

本課題組前期研究表明，嗜鹽四聯球菌是豆醬發酵過程中影響風味形成的關鍵菌種，與風味肽的合成代謝密切相關。在豆醬的不同發酵階段嗜鹽四聯球菌屬于優勢菌屬，但是目前還鮮有關于嗜鹽四聯球菌在發酵豆醬中生產鮮味肽提高其鮮味強度的報道。因此，本研究從96 份傳統發酵豆醬中分離出47 株嗜鹽四聯球菌，通過測定風味指標篩選出具有增鮮潛力的最佳菌株，旨在為拓寬嗜鹽四聯球菌在發酵食品中的應用奠定理論基礎，進而實現我國新型調味品的開發和行業水平提升，具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

豆醬樣品：采自遼寧沈陽、本溪、遼中、遼陽、大連、錦州、鞍山7 個地區96 份自然發酵豆醬。

標準菌ATCC 33315 中國普通微生物菌種保藏管理中心；CICC 10286、CICC 24788 中國工業微生物菌種保藏管理中心；CCTCC AB 2011059 中國典型培養物保藏中心。

1.1.2 試劑與培養基

那他霉素、氯化鈉、酪蛋白、三氯乙酸、氫氧化鈉（均為分析純） 北京索萊寶科技有限公司。

改良MRS培養基：大豆蛋白胨10.0 g、無水乙酸鈉3.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、七水合硫酸鎂0.575 g、一水合硫酸錳0.25 g、葡萄糖20.0 g、檸檬酸三鈉2.42 g、酵母浸粉4.0 g、牛肉浸膏8.0 g、吐溫80 1 g、氯化鈉100 g、蒸餾水1.0 L，pH 7.0。

產蛋白酶篩選培養基：酪蛋白10.0 g、酵母粉3.0 g、NaHPOg12HO 5.0 g、NaCl 50.0 g、溴麝香草酚藍0.05 g、瓊脂20.0 g、蒸餾水1.0 L，pH 7.0。

1.2 儀器與設備

酶標儀 美國BioTek公司；紫外-可見分光光度計龍尼柯（上海）儀器有限公司；電子舌 日本Insent公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 豆醬中嗜鹽四聯球菌的分離與鑒定

參考GB 4789.35ü2016《食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》方法處理。挑取菌落較小、有明顯溶鈣圈、呈乳白色且不透明，與乳酸菌菌落形態相似的單菌落，進行革蘭氏染色，選取對狀或四聯球狀的菌體純化培養保藏。參照《乳酸菌分類鑒定及實驗方法》及《常見細菌鑒定手冊》，生理生化特征鑒定主要包括：糖發酵實驗、明膠液化實驗、過氧化氫酶實驗、產氨實驗、硫化氫實驗、葡萄糖產酸產氣實驗、酪蛋白水解實驗、淀粉水解實驗、吲哚實驗和運動性檢測實驗。

參考武俊瑞等的方法稍作修改，進行分子生物學鑒定：提取G細菌DNA，利用引物27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG（5’-3’））和1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT（5’-3’）），PCR擴增其16S rDNA序列。將PCR產物送樣至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序工作。

1.3.2 高產鮮味肽嗜鹽四聯球菌篩選

1.3.2.1 培養條件

培養溫度為31 ℃，鹽質量濃度為10 g/100 mL，接種量為3%。

1.3.2.2 嗜鹽四聯球菌產蛋白酶活力測定

參照張延杰等的方法稍作修改。根據透明圈與菌落的面積比判斷菌株的產酶能力，從而篩選出具有產蛋白酶能力的菌株。采用酪蛋白法測定初篩菌株的蛋白酶活力。

1.3.2.3 嗜鹽四聯球菌產-谷氨酰轉肽酶（-glutamyl transpeptidase，-GT）活力測定

參照Li Xuepeng等的方法稍作修改。使用-GT活性檢測試劑盒（G-CLONE），用分光光度法測定-GT活性。

1.3.2.4 嗜鹽四聯球菌產多肽能力測定

參考Ruan Siyu等的方法稍作修改。將1 mL稀釋的改良MRS培養基發酵上清液添加到4 mL雙鎖脲試劑中。充分搖動混合物，并在室溫（25f1）℃放置30 min，然后在540 nm波長處測定吸光度。將0、2、4、8、10、12、16 mg/mL和20 mg/mL的Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標準溶液設置為標準曲線，結果以每毫升發酵液中的肽質量計，多肽含量計算公式如下：

式中：為樣品的吸光度；為樣品的稀釋倍數；0.000 6為標準曲線的截距；0.014 1為標準曲線的斜率。

1.3.2.5 電子舌測定

參照安飛宇等的方法稍作修改。對傳感器進行活化，電子舌系統自檢完成后，將發酵液直接倒入電子舌專用燒杯中，每個樣品重復檢測4 次，測試鮮味、咸味、酸味、澀味還有苦味，為減少系統誤差，原始數據選取后3 次測定的數據。

1.3.3 因子分析

主要步驟為：1）確定分析變量，收集數據資料；2）對原始數據進行標準化處理；3）計算相關系數矩陣；4）計算相關系數矩陣的特征值和貢獻率等；5）對因子載荷矩陣進行旋轉處理；6）計算因子得分。

1.4 數據統計及圖表繪制

采用Excel 2019對實驗數據進行處理和繪圖，使用IBM SPSS Statistics 21數據分析軟件對數據進行因子分析，數據均為3 次平行實驗的平均值。

2 結果與分析

2.1 豆醬中嗜鹽四聯球菌的分離鑒定

2.1.1 形態學鑒定

對7 個地區96 份東北自然發酵豆醬樣品進行預處理后，通過革蘭氏染色對其進行形態學觀察，共分離出疑似嗜鹽四聯球菌83 株。檢測其DNA的濃度和純度，發現菌株均符合PCR擴增體系的要求，后進行PCR擴增，對16S rDNA區域進行測定。根據菌落形態學觀察結果對83 株疑似嗜鹽四聯球菌進行16S rDNA序列同源性對比分析，得到47 株嗜鹽四聯球菌，如表1所示。

表1 菌株編號來源及16S rDNA序列同源性對比結果Table 1 Results of 16S rDNA sequence homology of 47 T.halophilus strains

續表1

2.1.2 生理生化特征

對待測菌株LY9-1進行生理生化實驗鑒定，結果如表2所示，菌株LY9-1不具有運動性，能夠利用葡萄糖產酸產氣，不產生吲哚，不液化明膠，不產生硫化氫，不產氨氣，過氧化氫酶、淀粉水解實驗結果為陰性，不能水解酪蛋白，可發酵半乳糖、甘露糖、麥芽糖以及果糖，不能發酵鼠李糖和木糖。根據細菌鑒定手冊可知符合嗜鹽四聯球菌的生理生化特征。

表2 菌株LY9-1的生理生化實驗結果Table 2 Results of physiological and biochemical test on strain LY9-1

選取菌株LY9-1擴增產物測定所得序列，與GenBank數據庫中己知序列進行比對，發現菌株LY9-1與嗜鹽四聯球菌的模式菌株處于同一分支，相似性達99.17%，可認為是屬內同種。同時，經生理生化實驗進一步確定菌株LY9-1為嗜鹽四聯球菌，使用MEGA7.0軟件進行序列分析，構建系統發育樹，如圖1所示。

圖1 LY9-1與相關菌株的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain LY9-1 and their relatives

2.2 呈鮮潛力最佳嗜鹽四聯球菌的篩選

2.2.1 嗜鹽四聯球菌產蛋白酶、-GT、多肽能力及電子舌分析

續表3

豆醬發酵中微生物分泌多種蛋白酶，可以將原料中的蛋白質水解為肽類，對改善豆醬風味起重要作用，同時由于豆醬中食鹽濃度較高，會抑制蛋白酶的活力，而嗜鹽四聯球菌屬于耐鹽乳酸菌，因此為了使大豆蛋白更好地降解，篩選蛋白酶活力高的耐鹽菌株尤為重要。如表3所示，相較于空白組，所有菌株均有產蛋白酶能力，47 株菌株中SY2-3蛋白酶活力最低，為（6.09f0.02）U/mL；LY9-1蛋白酶活力最高，達（85.45f0.03）U/mL。ATCC 33315蛋白酶活力為（48.28f0.02）U/mL，活性較高，具有一定代表性。

表3 嗜鹽四聯球菌產鮮指標實驗結果Table 3 Protease-producing capacity, γ-GT activity, peptide production and electronic tongue umami values of T.halophilus

-GT（EC 2.3.2.2）對發酵過程中呈鮮和增鮮有重要作用，在生物體的谷胱甘肽代謝途徑中是一個重要的關鍵酶。豆醬的鮮味很大程度上取決于Glu的濃度。發酵過程中，大豆蛋白被多種蛋白酶消化成肽，然后在發酵過程中肽被肽酶切割成氨基酸，釋放出來的Gln會被-GT水解成Glu。如果-GT量不足，則Gln會自發轉化為無味或微酸的焦谷氨酸。-谷氨酰肽是一類含有谷氨酸殘基的小分子肽，添加到含有基本味覺物質的食品體系中時，他們能夠與食品中的基本味覺物質相互協同增鮮，賦予其明顯的厚味或者增強厚味。如表3所示，47 株嗜鹽菌中，LY9-3產酶能力最高，達（53.67f0.02）U/mL，LY9-1產酶能力僅次于LY9-3，為（44.23f0.03）U/mL，遠超過空白組。菌株LZ7產酶能力最低，為（5.41f0.01） U/mL。

近年來小分子可溶性肽類物質是風味研究的重點，其能夠明顯改善食品味感或者掩蓋不良風味。研究發現，所有實驗組菌株的多肽質量濃度均遠高于空白對照組的（0.75f0.02）mg/mL，即可認定47 株嗜鹽四聯球菌均有產多肽能力。如表3所示，LY9-1發酵液多肽質量濃度最高，達（17.55f0.13）mg/mL，是ATCC 33315的4.71 倍。BX42-1發酵液多肽質量濃度最低，僅（0.04f0.01）mg/mL。

通過電子舌測定不同菌株大豆發酵液的鮮味值，如表3所示，LY9-1的鮮味值最高，高達15.05f0.02。同時，為免除培養基中牛肉膏、酵母浸粉對鮮味強度的干擾，設置了空白組。結果也表明其鮮味值遠大于空白組（9.13f0.00），LZ7鮮味值最低，為6.16f0.07。如圖2所示，對比LY9-1與ATCC 33315大豆發酵液以及空白組的9 種滋味，即酸味、甜味、苦味、咸味、鮮味、澀味、苦回味、澀回味和豐富度，發現實驗菌株與標準菌以及空白組的回味與咸味差別不大，甜味、酸味、鮮味有較大差異，同時發現實驗組的鮮味高于空白組，同時厚味也有所提升，可能是鮮味與厚味之間有協同作用。

圖2 嗜鹽四聯球菌LY9-1呈味特性Fig.2 Taste characteristics of the fermentation broth of T.halophilus LY9-1

2.2.2 因子分析

針對上述實驗結果，發現不同嗜鹽四聯球菌菌株產風味指標有所差異，為綜合評價不同嗜鹽四聯球菌菌株對風味的影響，在因子分析基礎上，利用因子得分對51 株嗜鹽四聯球菌進行風味評價。因子分析是通過相關系數矩陣的內在聯系，能找到少數幾個變量描述原始變量間的相關性。根據變量間相關性的大小進行分組，根據因子得分進行綜合評價的方法。從2010年起，應用因子分析法的論文每年有3 000多篇。說明因子分析法的應用有重要的學術價值和實踐意義。

2.2.2.1 KMO（Kaiser-Meyer-Olkin）和Bartlett球形檢驗

為確定不同風味指標數據是否適宜進行因子分析，首先對KMO和Bartlett球形檢驗進行分析，檢測結果如表4所示。KMO值為0.682，數值在0.5～1之間且接近于1，表明變量間的相關性較大。Bartlett球形檢驗，顯著性顯示為0.000，小于0.005，說明數據滿足總體正態分布。因此，不同嗜鹽四聯球菌的風味指標數據可進行因子分析。

表4 KMO和Bartlett球形檢驗Table 4 Results of KMO and Bartlett tests

2.2.2.2 不同嗜鹽四聯球菌呈味數據因子分析

用SPSS軟件對數據進行因子分析，依據表5可知，累計貢獻率達到83.188%，特征值為2.496，大于1，綜合了菌株呈味指標的大部分信息，因此提取1 個公因子即可。

表5 不同菌株風味指標的特征值和方差貢獻率Table 5 Eigenvalues and variance contribution rates of first three principal factors for flavor indexes of different strains

2.2.2.3 不同嗜鹽四聯球菌呈味能力綜合評價

如表6所示，3 個公因子載荷均較大，說明這3 類風味指標具有較強相關性。根據因子得分系數矩陣，發現多肽含量對嗜鹽四聯球菌呈味影響因素最大，根據各風味指標貢獻率的大小分配其權重，-GT活性、蛋白酶活性和多肽含量權重值分別為0.371、0.342和0.382，以此建立因子得分模型=0.371＋0.342＋0.382。

表6 旋轉后的載荷矩陣和因子得分系數矩陣Table 6 Rotated loading and component score coefficient matrix

因為只有1 個主成分，因此按各公因子對應的方差貢獻率為權數計算得綜合統計量，即值，最后根據所求值對菌株呈味效果進行排序，如表7所示，標準菌ATCC 33315在所有實驗組中綜合評分排名第33，推測其呈味效果適中。在47 株篩選自傳統發酵豆醬的嗜鹽四聯球菌中，呈味效果最強的菌株是LY9-1，最差的菌株是LZ7。

表7 因子綜合得分Table 7 Comprehensive scores of principal factors for 47 T.halophilus strains in decreasing order

3 結 論

從采集自7 個地區96 份東北自然發酵豆醬樣品中共分離出疑似嗜鹽四聯球菌83 株，根據菌落形態學觀察結果對83 株疑似嗜鹽四聯球菌進行16S rDNA序列同源性對比分析，得到47 株嗜鹽四聯球菌，同時對菌株LY9-1進行生理生化實驗鑒定，驗證其符合嗜鹽四聯球菌的基本特征。通過對47 株嗜鹽四聯球菌進行分離篩選，根據變異系數大小得出不同菌株對風味指標影響順序為多肽含量＞-GT活性＞蛋白酶活性，通過因子得分綜合評價了47 株嗜鹽四聯球菌的產風味能力高低，得到產風味能力最好的菌株為LY9-1，其產蛋白酶、產-GT酶和產多肽能力均較強。同時電子舌結果顯示LY9-1發酵液鮮味值最高，符合上述結果，推測嗜鹽四聯球菌LY9-1擁有產鮮味肽的潛力，進而促進發酵液鮮味的形成。我國對鮮味肽的研究尚處于起步階段，并且多數成果僅停留在實驗室階段，有關風味基因仍處在研究瓶頸期，已證實的呈鮮基因稀少，關于鮮味肽呈味機制等深層次研究仍亟待進一步加強。