魯米諾的合成與振蕩化學發光

張一平，鄧昆月，趙博軒，張雨豪，陳洲慧，阮永紅，周金梅，張慧君，林敏，鄧順柳，曹曉宇，任艷平

廈門大學化學化工學院，化學國家級實驗教學示范中心(廈門大學)，福建 廈門 361005

1 引言

魯米諾(Luminol)的化學名稱為3-氨基鄰苯二甲酰肼，具有化學發光的特性。在犯罪現場，血跡的勘察非常重要，而魯米諾試劑就在其中扮演著關鍵角色，它能夠與痕量血跡作用發出明顯的藍色熒光。超高的靈敏度使其被廣泛用于刑事偵查、化學示蹤、免疫分析等重要領域。

魯米諾的合成及其化學發光是極具展示度的基礎化學實驗，但目前國內開設相關實驗的高校還比較少[1–3]，著重點也多為合成，對化學發光性質的探索還僅限于現象的觀察。為進一步豐富該實驗的理論內涵并提高可推廣性，我們對其進行了合成方法改進，并基于其化學發光性質，設計了振蕩化學發光實驗。

為了提高魯米諾的產率和純度，以滿足后續振蕩化學發光的要求，我們對現有教材中的魯米諾合成方法進行了改進。首先，采用機械攪拌解決縮合反應體系粘度大的問題，使反應更加充分。其次，原還原步驟所選用的還原劑為連二亞硫酸鈉，存在反應劇烈和產品純度欠佳等缺點，將其替換為穩定、無毒的單質硫[4]不僅使還原反應更加安全、高效，而且顯著提高了產品純度。最后，經過多次嘗試，我們發現可將反應溶劑由甲醇替換為水，并且使用微波輻射可將反應時間從1 h縮短至9 min。以上改進使該實驗具備綠色、經濟、高效等優點，更適合高校基礎實驗教學。

魯米諾化學發光現象明顯，但轉瞬即逝。我們設計了振蕩化學發光實驗，即魯米諾/H2O2/SCN-/Cu2+/OH-振蕩體系化學發光動力學探究實驗，能夠觀察到周期性的化學發光現象，如同天上閃爍的星辰。目前基礎化學實驗中涉及的振蕩反應一般為碘鐘反應和B-Z振蕩反應[5,6]，現象更為明顯的振蕩化學發光實驗還未見開設。

為進一步豐富該實驗的科學內涵，我們設計并搭建了可在熒光光譜儀中使用的簡易微型磁力攪拌加熱裝置，配合熒光光譜儀，可以實時監測不同條件下溶液體系的發光情況，得到魯米諾振蕩化學發光強度與振蕩周期等信息。學生可自行設計對比實驗，探究反應物濃度、溫度、pH等條件對振蕩反應過程的影響，并利用這些數據討論振蕩反應機理。還可根據阿倫尼烏斯(Arrhenius)經驗公式計算振蕩反應的表觀活化能。

我們已在基礎化學實驗教學中進行過一輪嘗試。合成部分為學生單人實驗，振蕩化學發光部分為3–4人的小組實驗。如同星辰閃爍般的神奇實驗現象充分激發了學生的求知欲。該實驗涉及縮合反應、還原反應、動力學、非平衡態熱力學、化學發光等多個重要概念，使學生熟練掌握機械攪拌、溫度控制、微波合成、分離純化等基本有機合成操作，并學習熒光光譜儀的原理和使用方法。此外，還培養了學生獨立設計實驗及分析實驗數據的能力。

2 實驗部分

2.1 實驗原理

2.1.1 魯米諾的合成

魯米諾又名發光氨，在常溫下為淡黃色晶體或米黃色粉末，化學式為C8H7N3O2。魯米諾的合成涉及兩個重要有機反應(圖1)：a) 3-硝基鄰苯二甲酸與肼的縮合反應；b) 硝基的還原反應。

圖1 魯米諾的合成

2.1.2 魯米諾的化學發光

化學發光是指物質在發生化學反應時伴隨產生的一種發光現象。比如，在強堿性質子溶劑中，魯米諾可與強氧化劑反應，被氧化為激發態的3-氨基鄰苯二甲酸陰離子，其回到基態時以發射光子的形式釋放能量[7](圖2)。

圖2 魯米諾化學發光反應的機理

2.1.3 H2O2/SCN-/Cu2+/OH-振蕩體系

化學振蕩反應，也稱搖擺反應，其是指在一些自催化反應中，反應體系中某些物質的濃度隨時間或空間發生周期性的變化。該實驗中，我們使用的振蕩反應體系為H2O2/SCN-/Cu2+/OH-。一般認為該體系涉及的催化循環如圖3所示[8,9]。

圖3 H2O2/SCN-/Cu2+/OH-振蕩體系的催化循環過程

在Cu(I)與Cu(II)相互轉換的循環周期中，生成含氧自由基(HO·和HOO·)，當含氧自由基達到一定濃度后，氧化魯米諾發出藍色熒光。這個過程周而復始，從而展現出振蕩的化學發光現象。

2.1.4 魯米諾的振蕩化學發光原理

在H2O2/SCN-/Cu2+/OH-振蕩體系中，含氧自由基經過一段時間的積累，濃度達到一定值，從而氧化魯米諾發出藍色熒光，而后自由基濃度下降開始新的振蕩循環。可將熒光強度的極大值與基線的差值定義為振蕩振幅(圖4)。通過實時監測振蕩體系的發光強度，既能得到振蕩振幅，也能測定各振幅之間的時間間隔，即振蕩周期t。

圖4 振蕩振幅與周期

2.2 試劑

3-硝基鄰苯二甲酸(AR)、35%肼水溶液、二縮三乙二醇(AR)、升華硫(AR)、氫氧化鈉(AR)、鹽酸(AR)、30%過氧化氫(AR)、硫氰酸鉀(AR)、五水合硫酸銅(AR)。

2.3 儀器

2.3.1 主要儀器

機械攪拌裝置、電熱套、抽濾裝置、移液槍、MCR-3E常壓微波合成萃取儀、MR Hei-Teo磁力攪拌器、SHB-III循環水式多用真空泵、分析天平、核磁共振儀、F-7000熒光光譜儀。

2.3.2 自主設計的簡易微型磁力攪拌加熱裝置

為了控制溫度和使反應體系均勻，以實現在熒光光譜儀中對振蕩化學發光過程的實時準確監測，我們設計并搭建了簡易微型磁力攪拌加熱裝置(圖5)。該裝置主要由控制系統、攪拌系統與加熱系統構成。該裝置的所有零部件均可在網上購買，且價格便宜(約為100元)，方便推廣。

圖5 簡易微型磁力攪拌加熱裝置

2.4 實驗步驟

2.4.1 魯米諾的合成

投料：用夾子將100 mL三頸瓶固定在豎直方向上，在中間瓶口連接機械攪拌裝置，在左側瓶口插入溫度計，搭建如圖6所示的裝置。攪拌下依次加入2.50 g 3-硝基鄰苯二甲酸，5.0 mL 8%的肼水溶液和7.5 mL二縮三乙二醇。

圖6 縮合反應裝置

縮合：開啟機械攪拌，在電加熱套上加熱，直到固體溶解，溶液變為黃色。繼續升溫至沸騰，以除去過量的水。水蒸發完全后，溫度升至220 °C左右，溶液變為棕紅色，3-硝基鄰苯二甲酸與N2H4的縮合完成。移去熱源，溫度降至100 °C左右時，緩慢加入40 mL沸水，出現大量沉淀。降至室溫后，冰浴冷卻，抽濾析出黃棕色的3-硝基鄰苯二甲酰肼固體。

還原：將上步反應得到的3-硝基鄰苯二甲酰肼加入三頸瓶中，加入1.50 g硫粉和38.0 mL 10%NaOH溶液，攪拌，反應液加熱回流1 h或在400 W微波輻射下反應9 min，用薄層色譜監測反應進程。

后處理與分離：如圖7所示，連接恒壓滴液漏斗和氣體吸收裝置(用5% NaOH溶液吸收酸化過程中產生的酸性氣體)。攪拌下滴加3 mol·L-1鹽酸至體系pH為6 (用精密pH試紙5.5–9.0檢測)，析出大量淡黃色固體，抽濾，收集粗產品。

圖7 后處理反應裝置

將粗產品倒入150 mL燒杯中，攪拌下加入30 mL 10% NaOH溶液溶解魯米諾。抽濾，除去不溶的單質硫。將所得濾液用3 mol·L-1鹽酸酸化至pH為6，析出大量米黃色固體，抽濾，冰水洗滌，90oC烘干，收集魯米諾產品，兩步總產率約70%。

2.4.2 魯米諾振蕩化學發光

溶液配制：溶液A (2.0 mol·L-1H2O2)；溶液B (0.2 mol·L-1KSCN)；溶液C (3.0 × 10-3mol·L-1CuSO4)；溶液D (0.2 mol·L-1NaOH和8.0 × 10-3mol·L-1魯米諾)。

振蕩化學發光現象觀察：分別量取120.0 mL純水，20.0 mL溶液B，20.0 mL溶液C和20.0 mL溶液D于250 mL燒杯中。用磁力攪拌器攪拌并加熱至45 °C (該溫度時現象較明顯，有利于肉眼觀察)，然后加入20.0 mL溶液A。此時可以觀察到明顯的魯米諾振蕩化學發光現象(圖8)，記錄振蕩發光的時間間隔，即振蕩周期t。

圖8 振蕩化學發光現象觀察

實時監測振蕩發光過程：將微型磁力攪拌加熱裝置的攪拌模塊放置于熒光池正下方，在攪拌器和熒光池的中間放置加熱片。加熱溫度設置為35 °C。打開熒光光譜儀電源，設置好儀器參數。

向熒光池中加入純水，校準基線。立即移取已提前預熱的3.0 mL混合液于熒光池中，開啟測量，得到光強隨時間變化的曲線。測量完畢后，保存數據，用Origin軟件處理數據。

在此基礎上，學生可以繼續自行設計實驗，探究反應物濃度、溫度、pH等對該振蕩體系的振蕩振幅與周期的影響，總結振蕩反應規律和討論機理。還可引導學生通過探究不同溫度下振蕩周期的變化，結合阿倫尼烏斯經驗公式計算振蕩反應的表觀活化能。

3 結果與討論

3.1 3-硝基鄰苯二甲酰肼還原條件探索

通過探索3-硝基鄰苯二甲酰肼的還原條件(表1)，我們發現經典方法(Na2S2O4還原)雖然反應時間短[3]，但存在反應劇烈和產品純度欠佳等問題(序號1)，選用升華硫[4]作為還原試劑可以安全、高效制備高純度魯米諾(序號2–6)。尤其是，該反應可在水相(序號5)進行，更適合于高校基礎實驗教學。同時，使用微波輻射代替常規加熱能夠將反應時間從1 h縮短至9 min (序號6)。

表1 3-硝基鄰苯二甲酰肼還原條件探索

3.2 魯米諾的結構和純度表征

通過紅外光譜和核磁共振氫譜可對產物結構和純度進行表征。在紅外光譜(圖9)中可觀察到魯米諾分子結構中酰胺C＝O鍵的伸縮振動特征峰位于~1658 cm-1，酰胺的N―H鍵伸縮振動特征峰位于~3017 cm-1，芳胺的N―H鍵伸縮振動特征峰位于~3422 cm-1，與商品試劑紅外光譜的特征峰一致。

圖9 魯米諾產物與商品試劑紅外光譜對比

圖10為魯米諾的核磁共振氫譜，數據如下：1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ11.17 (s, 2H)，7.45(t,J= 7.9 Hz, 1H)，7.29 (s, 2H)，6.95 (d,J= 7.5 Hz, 1H)，6.89 (d,J= 8.2 Hz, 1H)。

圖10 (a) 魯米諾產品核磁共振氫譜圖；(b) 魯米諾產物與商品試劑譜圖對比

3.3 探究影響魯米諾振蕩化學發光反應的因素

3.3.1 魯米諾濃度的影響

我們監測了35 °C攪拌條件下魯米諾振蕩化學發光光強隨時間的變化。根據振蕩體系中不同反應物濃度對光強及振蕩周期的影響，總結振蕩反應規律，供學生參考。

如圖11所示，隨著體系中魯米諾濃度的增加，振幅稍增大，但振蕩周期的變化不大，因為決定振蕩周期的是Cu2+催化H2O2分解的過程，魯米諾作為發光指示劑，對振蕩周期影響不大。

圖11 不同魯米諾濃度下魯米諾/H2O2/SCN-/Cu2+/OH-振蕩體系化學發光動力學曲線

3.3.2 KSCN濃度的影響

如圖12所示，隨著體系中KSCN濃度的增加，振幅增大，振蕩周期變長。因為KSCN濃度增加，促進SCN-與Cu2+的配位形成[CuII(SCN)n]2-n，使得體系中Cu2+濃度下降，因而振蕩周期變長。同時，一個振蕩周期內累積的含氧自由基濃度增加，振幅增大。

圖12 不同KSCN濃度下魯米諾/H2O2/SCN-/Cu2+/OH-振蕩體系化學發光動力學曲線

3.3.3 CuSO4濃度的影響

如圖13所示，隨著CuSO4濃度的增加，Cu2+作為催化劑，加快振蕩反應速率，從而使得周期變短。同時由于單位周期內累積的含氧自由基濃度減小，振幅減小。

圖13 不同CuSO4濃度下魯米諾/H2O2/SCN-/Cu2+/OH-振蕩體系化學發光動力學曲線

3.3.4 H2O2濃度的影響

如圖14所示，隨著體系中H2O2濃度的增大，振蕩周期變短，振幅增大。因為H2O2作為反應物，其濃度增加，使得Cu2+催化H2O2分解的速率變快，振蕩周期縮短。同時，H2O2濃度增加使分解產生的含氧自由基的濃度增加，因此振幅增大。

圖14 不同H2O2濃度下魯米諾/H2O2/SCN-/Cu2+/OH-振蕩體系化學發光動力學曲線

3.3.5 溫度的影響：計算表觀活化能

與上述方法類似，我們用F-7000熒光光譜儀測定了不同溫度下振蕩周期隨時間的變化，結果如表2所示。其中各組分濃度為：溶液A (2.0 mol·L-1H2O2)；溶液B (0.2 mol·L-1KSCN)；溶液C (3.0 ×10-3mol·L-1CuSO4)；溶液D (0.2 mol·L-1NaOH和8.0 × 10-3mol·L-1魯米諾)。

表2 不同溫度下的振蕩周期變化

根據阿倫尼烏斯方程，振蕩周期t與溫度T的關系可表示為：lnt= -lnA+Ea/RT。其中，Ea是表觀活化能，R是理想氣體常數(8.31 J·mol-1·K-1)，T是Kelvin溫度，A是經驗常數。以lnt對1/T× 103作圖(圖15)，從直線斜率可求振蕩反應的表觀活化能Ea(52.3 kJ·mol-1)。

圖15 魯米諾振蕩化學發光反應lnt-1/T×103關系

4 結語

對標國家建設一流課程的“兩性一度”(高階性、創新性和一定的挑戰度)要求，我們對“魯米諾的合成與化學發光實驗”進行了改進和拓展，希望能更有效推廣這個科學內涵豐富且極具展示度的基礎化學實驗。

將現有教材中魯米諾合成過程用到的磁力攪拌、保險粉還原和常規加熱改進為機械攪拌、硫粉還原和微波合成，實現了安全、快速、高效制備高純度魯米諾的目的。

基于魯米諾的化學發光性質，設計了振蕩化學發光實驗，周期性的發光現象就如同天上一閃一閃的小星星；通過自行設計并搭建簡易微型磁力攪拌加熱裝置，與熒光光譜儀配套使用，精確測定振蕩化學發光的振幅與周期，并根據阿倫尼烏斯經驗公式計算振蕩反應的表觀活化能。

該實驗涉及多學科的重要知識點，儀器簡單，可操作性強，易于推廣。本校已開展過一輪教學實踐，合成部分學生獨自開展，振蕩化學發光部分以小組合作方式進行，整個實驗可在8 h內完成，學生有充足的時間自行設計對比實驗，進而總結反應規律并探討振蕩反應機理。開放性的實驗設計極大提高了學生提出問題和解決問題的積極性。

5 創新性

1) 引入機械攪拌、硫粉還原和微波合成，確保安全、快速、高效地制備高純度魯米諾。

2) 將與非平衡態熱力學有關的振蕩化學發光反應引入基礎實驗教學。

3) 借助自主設計的簡易微型磁力攪拌加熱裝置，利用熒光光譜儀實時定量監測振蕩化學發光過程。

致謝：感謝廈門大學化學化工學院陳曦教授、王翊如副教授、周劍章副教授、陳毅輝副教授等老師和廈門大學化學國家級實驗教學示范中心技術人員的幫助和指導。