基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探討黃芪治療病毒性心肌炎的作用機(jī)制

李中豪，顧凱元，任晉宏

1山西中醫(yī)藥大學(xué)，晉中 030619；2南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210023；3沈陽藥科大學(xué)，沈陽 110016

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是因病毒對心肌直接造成損傷或因自身免疫炎性反應(yīng)而誘發(fā)心肌局灶性或彌漫性的炎蝕病變，其臨床主要表現(xiàn)為患者發(fā)病前多出現(xiàn)腸道或上呼吸道感染癥狀，輕癥患者無任何癥狀，而重者則出現(xiàn)休克、猝死等癥狀[1]。VMC的發(fā)病率大約為每10萬人中10至22人[2]。但迄今尚無具體的臨床治療特效藥物，抗病毒和營養(yǎng)心肌藥物主要用于有效控制患者的病情。

結(jié)合VMC臨床表現(xiàn)，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，VMC應(yīng)歸屬于“溫病”“胸痹”“心悸”等范疇[3]。其病因?yàn)槿酥龤馓澨?，而外感溫?zé)嵝岸?；病機(jī)為因熱毒內(nèi)侵，致人氣陰耗傷，致瘀血阻絡(luò)、心失所養(yǎng)，患者多出現(xiàn)虛、滯、瘀等表現(xiàn)[4]，治療上講究分期辯證與分型辯證相結(jié)合，應(yīng)強(qiáng)調(diào)益氣養(yǎng)陰、活血化瘀。近年來，眾多研究證明黃芪在治療VMC方面療效甚佳，臨床常單用黃芪注射液或聯(lián)合其他藥物共同治療VMC[5,6]，已于臨床推廣。

傳統(tǒng)中藥黃芪含黃芪多糖、黃芪甲苷、黃芪黃酮、槲皮素、山奈酚等多種活性成分。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，黃芪及其活性成分單體(如黃芪甲苷、黃芪黃酮、黃芪多糖等)治療病毒性心肌炎的潛在機(jī)制較多，包括氧化應(yīng)激作用、免疫調(diào)節(jié)作用、抑制炎性反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等方面[7]，然而詳細(xì)作用機(jī)制尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一門新興研究學(xué)科，首次由英國藥理學(xué)家Hopkins提出概念[8]，近年來發(fā)展迅速。它憑借系統(tǒng)生物學(xué)理論基礎(chǔ)，對藥物活性成分及其潛在作用靶點(diǎn)和信號通路進(jìn)行預(yù)測，以期提高藥效研究或臨床試驗(yàn)的準(zhǔn)確性[9]。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)預(yù)測黃芪治療病毒性心肌炎的活性成分及相關(guān)靶標(biāo)和通路，以期闡明其生物過程及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 篩選黃芪活性成分

本研究通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，篩選黃芪活性成分信息。其中篩選條件為“口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%且類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18”，獲得20個(gè)活性成分。此外，查閱相關(guān)文獻(xiàn)[10]，整理活性成分單體納入討論。

1.2 收集黃芪活性成分潛在靶點(diǎn)

本研究將黃芪潛在靶點(diǎn)分為已驗(yàn)證靶點(diǎn)和預(yù)測所得靶點(diǎn)兩部分。

活性成分已驗(yàn)證靶點(diǎn)是通過Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中生物測定結(jié)果(BioAssay results)得到數(shù)據(jù)，然后限定“Active”和“Human”來篩選已驗(yàn)證靶點(diǎn)。最后利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)將備選藥物靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換成基因名稱。

預(yù)測靶點(diǎn)是首先查詢Pubchem數(shù)據(jù)庫中黃芪活性成分的SMILES，將其輸入SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)中，依據(jù)化學(xué)相似性尋找靶點(diǎn)。并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫將靶點(diǎn)規(guī)范化基因名稱，并剔除非人類或未驗(yàn)證UniprotID的基因。

最后匯總兩部分靶點(diǎn)，刪去重復(fù)靶點(diǎn)信息，獲得黃芪活性成分靶點(diǎn)庫。

1.3 構(gòu)建“黃芪活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

將上述獲得的活性成分及靶點(diǎn)建立相應(yīng)的數(shù)據(jù)表，并將其作為輸入文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件中，以完成“黃芪活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，對黃芪活性成分及靶點(diǎn)進(jìn)行可視化分析。

1.4 收集病毒性心肌炎疾病靶點(diǎn)及黃芪作用靶點(diǎn)

分別通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/)及DisGeNET數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org/)以“viral myocarditis”為關(guān)鍵詞檢索與VMC相關(guān)的基因，去重后獲得VMC相關(guān)基因。將挖掘到的VMC相關(guān)基因與黃芪活性成分的靶點(diǎn)基因映射篩選以獲取交集靶點(diǎn)，即黃芪活性成分治療VMC的潛在作用靶點(diǎn)，并繪制Venn圖。

1.5 構(gòu)建“黃芪活性成分-VMC-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

依據(jù)所得數(shù)據(jù)，建立網(wǎng)絡(luò)文件和屬性文件，并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件中，以構(gòu)建“黃芪活性成分-VMC-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。接著利用network analyzer等插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)特征分析，來突出黃芪中較重要的活性成分及潛在靶點(diǎn)。

1.6 構(gòu)建黃芪-VMC靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)和歸屬作用靶點(diǎn)類型

將交集靶點(diǎn)輸入String在線軟件(https://string-db.org/)，其中篩選條件限定物種為人，最低互作分?jǐn)?shù)為0.4，保存數(shù)據(jù)結(jié)果。其次將數(shù)據(jù)結(jié)果文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件中構(gòu)建蛋白互作(PPI)圖，計(jì)算出degree值以調(diào)整靶點(diǎn)大小及顏色，區(qū)分靶點(diǎn)重要程度。接著借助DisGeNET數(shù)據(jù)庫對degree值較大的作用靶點(diǎn)進(jìn)行檢索，獲取靶點(diǎn)類型信息，來推測重要靶點(diǎn)在治療過程中可能發(fā)揮的作用。

1.7 GO功能分析與KEGG通路富集

將黃芪-VMC交接靶點(diǎn)使用R語言進(jìn)行基因本體(GO)富集分析和KEGG通路分析，設(shè)置P<0.01為篩選標(biāo)準(zhǔn)，整理結(jié)果按照Pvalue大小排序，并繪GO功能分析、KEGG通路富集信息柱狀圖及氣泡圖。整理分析結(jié)果數(shù)據(jù)，篩選富集程度較高的前20條通路，利用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“靶點(diǎn)-KEGG通路”網(wǎng)絡(luò)。

1.8 分子對接

為檢驗(yàn)黃芪關(guān)鍵活性成分及重要靶點(diǎn)的結(jié)合方式和契合度，本研究選擇連接靶點(diǎn)數(shù)目最多的前8種活性成分和5個(gè)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)依次進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。首先從TCMSP數(shù)據(jù)庫中下載活性成分的mol2格式文件，利用Sybylx-2.0軟件進(jìn)行能量優(yōu)化，獲得修正后的小分子mol2格式文件。隨后從RSCB PDB數(shù)據(jù)庫中(http://www.rcsb.org/)中篩選5個(gè)重要靶點(diǎn)蛋白較合適的蛋白結(jié)構(gòu)，并下載其PDB格式文件。接著將蛋白結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Sybylx-2.0中進(jìn)行預(yù)處理，包括修正蛋白、提取配體結(jié)構(gòu)、刪除水分子、為蛋白加氫等。最后，利用Sybylx-2.0中的Surflex-Dock功能依次將小分子與蛋白進(jìn)行分子對接，利用Total Score評價(jià)對接結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 黃芪活性成分的篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索“黃芪”，獲得符合條件的20種活性成分；檢索文獻(xiàn)獲得對VMC有明顯治療效果的成分：黃芪甲苷和黃芪三萜皂苷。因此，共獲得22種黃芪活性成分，結(jié)果見表1。

2.2 黃芪活性成分潛在靶點(diǎn)的收集

通過上述數(shù)據(jù)庫獲得已驗(yàn)證靶點(diǎn)200個(gè)，預(yù)測所得靶點(diǎn)418個(gè)，匯總?cè)ブ睾蠊搏@得黃芪活性成分潛在靶點(diǎn)505個(gè)。

2.3 “黃芪活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用Cytoscape 3.7.1對黃芪活性成分和潛在作用靶點(diǎn)的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行繪制和分析，如圖1所示，構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)共獲得528個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 392個(gè)關(guān)系，圖中橙色方塊代表潛在靶點(diǎn)，黃色菱形代表黃芪活性成分。

2.4 疾病靶點(diǎn)及藥物作用靶點(diǎn)的篩選

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得847個(gè)靶點(diǎn)，OMIM數(shù)據(jù)庫獲得248個(gè)靶點(diǎn)，GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得129個(gè)靶點(diǎn)，去除重復(fù)靶點(diǎn)，最終獲得1 116個(gè)VMC疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

將黃芪潛在靶點(diǎn)與VMC疾病相關(guān)靶點(diǎn)取交集，共收集到97個(gè)共同靶點(diǎn)(見圖2)。

圖1 “黃芪活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)Fig.1 “Astragali Radix active ingredient-target” network

2.5 “黃芪-VMC-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

使用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建的“黃芪-VMC-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)如圖3所示，共獲得120個(gè)節(jié)點(diǎn)和397個(gè)關(guān)系。圖中六邊形代表病毒性心肌炎，圓形代表黃芪活性成分，八邊形代表這些活性成分治療VMC的相關(guān)作用靶點(diǎn)。圖形填充的顏色越深，表示這個(gè)成分或者靶點(diǎn)相連的邊越多，即節(jié)點(diǎn)的degree越高。其中槲皮素相連34個(gè)靶點(diǎn)，3,9-二-O-甲基尼森香豌豆紫檀酚相連25個(gè)靶點(diǎn)，山奈酚相連23個(gè)靶點(diǎn)，(3R)-3-(2-羥基-3,4-二甲氧基苯基)鉻-7-醇相連22個(gè)靶點(diǎn)，華良姜素相連22個(gè)靶點(diǎn)，美迪紫檀素相連19個(gè)靶點(diǎn)，白樺脂酸相連17個(gè)靶點(diǎn)，異鼠李素相連13個(gè)靶點(diǎn)。這提示黃芪在治療VMC方面上述成分會起到關(guān)鍵作用。

圖2 疾病與藥物交集靶點(diǎn)韋恩圖Fig.2 Venn diagram of the intersection of disease and drug target

圖3 “黃芪活性成分-VMC-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)Fig.3 “Astragali Radix active ingredient-VMC-target” network

2.6 PPI圖的構(gòu)建

圖4展示了根據(jù)黃芪潛在作用的97個(gè)靶點(diǎn)繪制所得的PPI網(wǎng)絡(luò)，共有96個(gè)靶點(diǎn)蛋白節(jié)點(diǎn)(有1個(gè)靶點(diǎn)游離，與其他蛋白無相互作用)，共有1 271條邊。其中顏色較深的靶點(diǎn)蛋白有ALB、TP53、AKT1、MAPK3、VEGFA、CASP3、EGFR等，表明相連的其他靶點(diǎn)數(shù)目較多。通過Cytoscape 3.7.1軟件的網(wǎng)絡(luò)分析工具，將degree值≥50的重要靶點(diǎn)依次導(dǎo)入DisGeNET數(shù)據(jù)庫，獲取靶點(diǎn)對應(yīng)的類型，詳細(xì)信息見表2。

2.7 基因功能及通路分析

利用R語言對97個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析和KEGG通路分析，設(shè)定閾值P<0.01。GO富集分析包括3個(gè)分支，分別是細(xì)胞組分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)和生物過程(biological process，BP)對基因產(chǎn)物進(jìn)行相關(guān)注釋。

CC分析中可知，相關(guān)靶點(diǎn)主要涉及膜(membrane)、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體(transcription factor complex)、細(xì)胞質(zhì)囊泡腔(cytoplasmic vesicle lumen)、細(xì)胞-底物連接(cell-substrate junction)以及免疫突觸(immunological synapse)等。MF分析中，這些靶點(diǎn)很大程度上與磷酸酶結(jié)合(phosphatase binding)、細(xì)胞因子受體結(jié)合(cytokine receptor binding)、絲氨酸水解酶活性(serine hydrolase activity)、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性(protein tyrosine kinase activity)及轉(zhuǎn)錄因子的活性(transcription factor activity)等功能有關(guān)。BP分析，上述靶點(diǎn)大多涉及對營養(yǎng)水平和氧氣水平的反應(yīng)(response to nutrient and oxygen levels)、對肽基酪氨酸的修飾調(diào)控(modification and regulation of peptide tyrosine)、ERK1和ERK2級聯(lián)的調(diào)控(regulation of ERK1 and ERK2 cascade)、細(xì)胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)(response to oxidative stress)。取排名前10的通路建立柱狀圖，如圖5所示。

圖5 黃芪活性成分潛在治療VMC靶點(diǎn)的GO分析圖Fig.5 GO analysis of Astragali Radix active ingredients for potential treatment of VMC targets

排名前20的KEGG通路富集信息氣泡圖(見圖6)結(jié)果顯示，黃芪治療VMC的主要靶點(diǎn)主要涉及PI3K-Akt信號通路(22個(gè)靶點(diǎn)/24%)、TNF信號通路(15個(gè)靶點(diǎn)/16%)、細(xì)胞凋亡通路(15個(gè)靶點(diǎn)/16%)及Th17細(xì)胞分化(13個(gè)靶點(diǎn)/14%)等信號通路。

圖6 黃芪治療VMC關(guān)鍵靶點(diǎn)參與的通路富集信息氣泡圖Fig.6 Bubble map of pathway enrichment information involved in key targets of Astragali Radix in the treatment of VMC

依據(jù)KEGG通路分析數(shù)據(jù)結(jié)果，繪制出“靶點(diǎn)-KEGG通路”網(wǎng)絡(luò)(見圖7)，共得到78個(gè)節(jié)點(diǎn)和310個(gè)關(guān)系。圖中菱形代表關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，六邊形代表KEGG富集前20的通路。根據(jù)圖形的透明度代表這個(gè)靶點(diǎn)或通路的富集程度。由圖7可觀察到，TP53(腫瘤蛋白p53)、AKT1(AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶1)、EGFR(表皮生長因子受體)、CASP3(半胱天冬酶3)、VEGFA(血管內(nèi)皮生長因子A)等靶點(diǎn)及PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路等通路富集程度較高。

圖7 “靶點(diǎn)-KEGG通路”網(wǎng)絡(luò)Fig.7 “Target-KEGG pathway” network

2.8 分子對接結(jié)果

Dock系統(tǒng)對接Total score>4.25時(shí)，表明分子與靶點(diǎn)之間存在結(jié)合活性，Total score>5.0證明結(jié)合活性較高，Total score>7.0說明兩者存在強(qiáng)烈的結(jié)合活性[11]。本研究選擇連接靶點(diǎn)數(shù)目最多的前8種活性成分(包括槲皮素、3,9-二-O-甲基尼森香豌豆紫檀酚、山奈酚、華良姜素、(3R)-3-(2-羥基-3,4-二甲氧基苯基)鉻-7-醇、異鼠李素、美迪紫檀素和白樺脂酸)和5個(gè)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)(TP53、AKT1、EGFR、CASP3和VEGFA)依次進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，對接參數(shù)詳見表3。結(jié)果以熱圖的形式呈現(xiàn)(見圖8)，其中數(shù)值代表分子對接作用的分值，數(shù)值越大表示黃芪中的活性成分與靶點(diǎn)蛋白的分子對接親和作用越強(qiáng)。

表3 黃芪活性成分與靶點(diǎn)分子對接結(jié)果

續(xù)表3(Continued Tab.3)

圖8 黃芪活性成分與靶點(diǎn)分子對接結(jié)果Fig.8 Docking results of active components of Astragali Radix and target molecules注：a：白樺脂酸；b：(3R)-3-(2-羥基-3,4-二甲氧基苯基)鉻-7-醇；c：華良姜素；d：槲皮素；e：美迪紫檀素；f：山奈酚；g：3,9-二-O-甲基尼森香豌豆紫檀酚；h：異鼠李素。Note:a:Mairin;b:(3R)-3-(2-Hydroxy-3,4-dimethoxyphenyl)chroman-7-ol;c:Jaranol;d:Quercetin;e:(6aR,11aR)-9,10-Dimethoxy-6a,11a-dihydro-6H-benzofurano[3,2-c]chromen-3-ol;f:Kaempferol;g:3,9-Di-O-methylnissolin;h:Isorhamnetin.

由上述圖表可知，TP53與(3R)-3-(2-羥基-3,4-二甲氧基苯基)鉻-7-醇(8.057 4)、AKT1與白樺脂酸(7.769 4)、EGFR與(3R)-3-(2-羥基-3,4-二甲氧基苯基)鉻-7-醇(7.517 3)、CASP3與山奈酚(6.190 3)結(jié)合情況較好。以上分子對接模式見圖9，配體與受體結(jié)合構(gòu)象模式越穩(wěn)定，提示黃芪活性成分在治療VMC發(fā)揮作用的可能性越大。

3 討論與結(jié)論

黃芪作為傳統(tǒng)補(bǔ)氣藥，有著補(bǔ)脾益氣、脫毒生肌等功效。而黃芪的不同主要活性成分在治療病毒性心肌炎上影響不同，各有優(yōu)勢。本研究中，將黃芪的22個(gè)活性成分納入討論，共獲得505個(gè)藥物靶點(diǎn)，與VMC相關(guān)的靶點(diǎn)1 116個(gè)。其中槲皮素、3,9-二-O-甲基尼森香豌豆紫檀酚、山奈酚、(3R)-3-(2-羥基-3,4-二甲氧基苯基)鉻-7-醇、華良姜素等相連靶點(diǎn)數(shù)目較多，在治療VMC方面會起到關(guān)鍵作用。已有研究證明，槲皮素是通過激活PI3K/Akt通路，來減輕CVB3誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的[12]。此外，槲皮素還能抑制炎性反應(yīng)，具體表現(xiàn)為IL-1β、IL-6和iNOS水平降低[13]。而黃酮類化合物山奈酚能通過mTOR通路，抑制缺氧心肌細(xì)胞的凋亡[14]。而其他成分如何發(fā)揮作用還有待研究。

圖9 黃芪活性成分與靶點(diǎn)分子對接模式Fig.9 Docking mode of Astragali Radix active components and target molecules注：A：TP53與(3R)-3-(2-羥基-3,4-二甲氧基苯基)鉻-7-醇；B：CASP3與山奈酚；C：EGFR與(3R)-3-(2-羥基-3,4-二甲氧基苯基)鉻-7-醇；D：AKT1與白樺脂酸。Note:A:TP53 and (3R)-3-(2-hydroxy-3,4-dimethoxyphenyl)chroman-7-ol;B:CASP3 and kaempferol;C:EGFR and (3R)-3-(2-hydroxy-3,4-dimethoxyphenyl)chroman-7-ol;D:AKT1 and mairin.

根據(jù)“黃芪活性成分-VMC-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)以及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析可知，能作用疾病的潛在靶點(diǎn)97個(gè)，可見黃芪治療VMC具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。重要的靶點(diǎn)蛋白(如ALB、TP53、AKT1、MAPK3、VEGFA、CASP3、EGFR等)，它們的蛋白類型不同包括轉(zhuǎn)錄因子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子、酶、轉(zhuǎn)運(yùn)因子等，這提示多靶點(diǎn)發(fā)揮協(xié)同治療作用，這也體現(xiàn)了中醫(yī)藥治療疾病的整體性與系統(tǒng)性。其中已有研究證明[15,16]，黃芪能顯著降低心肌組織中凋亡相關(guān)因子Caspase-3的表達(dá)水平，減輕心肌細(xì)胞凋亡程度。而其他因子的影響情況可以作為今后研究切入的方向。

白介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)是重要的促炎細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞炎性反應(yīng)。多項(xiàng)研究證明[17,18]，黃芪治療VMC后，血清中細(xì)胞炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α水平顯著降低，有效緩解患者體內(nèi)炎癥反應(yīng)。STAT3(轉(zhuǎn)錄活化因子3)信號通路被激活，會誘發(fā)心肌內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，從而促進(jìn)心肌血管生長，減慢心肌細(xì)胞凋亡[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，黃芪治療VMC的過程中對STAT3及其通路有影響[20]，主要是影響病毒的復(fù)制，而對正常心肌細(xì)胞的功能不會產(chǎn)生影響。此外，黃芪還能下調(diào)心肌組織中Caspase-3的表達(dá)[16]，來減輕心肌細(xì)胞凋亡程度。其他靶點(diǎn)的作用方式值得進(jìn)一步探索。

通過靶點(diǎn)GO富集分析，結(jié)果提示位于膜組織、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體、免疫突觸等細(xì)胞組分上的黃芪關(guān)鍵基因，可能通過影響潛在靶點(diǎn)與相關(guān)激酶、細(xì)胞因子受體、轉(zhuǎn)錄因子等的結(jié)合，從而調(diào)控營養(yǎng)水平、氧氣水平、級聯(lián)反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)等生物過程來治療病毒性心肌炎的。靶細(xì)胞表面的Fas受體能與膜表面的FasL受體蛋白結(jié)合，可誘發(fā)靶細(xì)胞凋亡。Liu等[21]研究提示，黃芪或許是通過下調(diào)VMC小鼠心肌組織相關(guān)細(xì)胞表面的FasL與Fas基因轉(zhuǎn)錄，來減少Fas和FasL的表達(dá)發(fā)揮保護(hù)心肌作用。免疫突觸可能也十分重要。Qi等[22]研究證明黃芪注射液能激活Treg細(xì)胞的免疫應(yīng)答，進(jìn)而分泌IL-10和TNF-β，抑制Th17細(xì)胞分泌IL-17和IL-21，發(fā)揮保護(hù)心肌作用。Zhang等[15]的基礎(chǔ)研究證明，黃芪三皂苷(AST)可以顯著抑制小鼠外周血中肌酸激酶同工酶(CK-MB)及乳酸脫氫酶(LDH)水平。已有臨床研究證明[18]，黃芪能通過抑制氧化應(yīng)激的激活與擴(kuò)散，減輕心肌損傷，從而起到保護(hù)心肌的作用。而營養(yǎng)條件和氧氣供給對于心功能不足患者來說尤為重要，提示黃芪活性成分可能通過改善和調(diào)節(jié)患者的營養(yǎng)和氧氣情況，來減輕心肌損傷的。有研究發(fā)現(xiàn)[17,23]，黃芪抑制炎性反應(yīng)發(fā)揮治療VMC作用時(shí)，大多會下調(diào)TNF-α的表達(dá)。Zhong等[24]的基礎(chǔ)研究證明，使用黃芪甲苷治療后小鼠的心肌浸潤和壞死積分明顯降低，病灶周圍細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯減輕。由此證明，黃芪治療VMC可能是多靶點(diǎn)、多通路的調(diào)節(jié)機(jī)制。

就目前已有研究來看，黃芪治療病毒性心肌炎機(jī)制較多，可能與氧化應(yīng)激反應(yīng)、抑制炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)等都存在一定的相關(guān)性。在KEGG通路富集分析后，提示這些機(jī)制或許與PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、細(xì)胞凋亡通路及Th17細(xì)胞分化等信號通路有關(guān)。此外，還有一些尚未涉及的生物過程和通路(如糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、ErbB信號通路、MAPK信號通路、松弛素信號通路、人巨細(xì)胞病毒感染)有待發(fā)掘和驗(yàn)證。

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，本研究闡述了中藥黃芪治療病毒性心肌炎的活性成分、潛在作用靶點(diǎn)及發(fā)揮藥效的生物學(xué)通路。研究結(jié)果初步揭示了黃芪治療VMC的相關(guān)作用機(jī)制，為接下來深入研究其藥理作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。然而，本研究還存在一定的不足，僅借助數(shù)據(jù)庫現(xiàn)有已驗(yàn)證數(shù)據(jù)對黃芪治療VMC的藥效機(jī)制進(jìn)行預(yù)測，還需要通過許多基礎(chǔ)研究和臨床研究進(jìn)行驗(yàn)證。因此，本研究旨在為黃芪治療病毒性心肌炎相關(guān)的作用機(jī)制提供思路和參考。