不同寄主桑寄生中化學成分的差異性分析

袁嘉歡，吳 楠，王文辛，蔡芷辰，殷圣鑫，陳海杰，劉訓紅,2*，黎 理

1南京中醫藥大學；2江蘇省經典名方工程研究中心，南京210023；3廣西中醫藥大學，南寧 530200

桑寄生Taxilli Herba為桑寄生科植物桑寄生Taxilluschinensis(DC.) Danser的干燥帶葉莖枝；為廣西著名道地藥材[1]，主要分布于廣西的桂南、桂中、桂東地區；收載于2020版《中國藥典》，具有祛風濕、補肝腎、強筋骨、安胎元之功效，用于治療風濕痹痛，腰膝酸軟，筋骨無力等癥[2]。現代研究表明，桑寄生主要含有黃酮類[3,4]、有機酸類[5]、萜類[6]等多種類型化學成分，具有抗炎鎮痛[7]、降血糖[8]、抗腫瘤[9,10]等多重藥理作用。桑寄生屬于半寄生性植物，寄主多達36科150多種[11]。《中國藥典》對桑寄生的寄主植物沒有明確規定，目前市場上流通和使用的多為多寄主基源藥材，質量參差不齊。不同歷史時期的本草學已有不同寄主對桑寄生藥材質量影響的詳實記載，并已注意到不同寄主桑寄生藥材的毒性、藥效均有不同[12-14]。近年來，寄主與桑寄生藥材質量關系的研究表明，不同寄主來源桑寄生中總黃酮、槲皮素和槲皮苷含量存在明顯差異[15-18]，桑寄生會以一定的形式累積寄主植物的特征性成分[19,20]，同時不同寄主來源桑寄生中揮發性成分的種類和含量也存在差異[21]。Xia等[22]發現桑樹寄主桑寄生水提物無肝損傷，漆樹、油茶、柳樹、苦楝和夾竹桃5種寄主桑寄生表現出不同程度的肝損傷。Zhang等[23]發現各寄主來源桑寄生均具有降壓作用，寄主對桑寄生的降血壓作用存在影響。

目前對于不同寄主來源桑寄生的研究多集中于總黃酮含量的變化[16,17]、HPLC特征指紋圖譜研究[24]及應用紅外光譜方法[25]區分不同寄主桑寄生，對不同寄主來源桑寄生中化學成分的差異性研究尚未見報道。因此，對不同寄主來源桑寄生差異性化學成分進行研究，對完善其質量控制體系具有重要意義。本實驗借鑒植物代謝組學的研究思路與方法[26]，采用超快速液相色譜-三重四極桿飛行時間串聯質譜(UFLC-Triple TOF-MS/MS)技術分析不同寄主來源桑寄生化學成分的差異性，并通過多元統計分析找出差異顯著的化學成分及其變化規律，旨在為揭示寄主植物對桑寄生代謝產物合成和積累的影響規律及探討桑寄生藥材的品質形成機制提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Triple TOFTM5600 System-MS/MS 高分辨四極桿飛行時間質譜儀(配有Peakview 1.2 數據處理系統，美國AB Sciex 公司)；SIL-20A XR 超快速液相色譜儀(日本 Shimadzu公司)；Q-500B高速多功能粉碎機(上海冰都電器有限公司)；ME36S型電子分析天平(1/100萬，德國賽多利斯公司)；BSA224S型電子分析天平(1/1萬，德國賽多利斯公司)； PT-124/85S型電子分析天平(1/10萬，華志電子科技有限公司)；Milli-Q超純水制備儀(美國Millipore公司)；KQ-500B超聲波清洗機(超聲功率500W，40kHz，昆山超聲儀器有限公司)；H1650-W高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)。

對照品：槲皮素 3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(批號DST200703-055)、異櫻花素(批號DST201227-161)購于南京良緯生物科技有限公司；金絲桃苷(批號P12S11F124379)、(+)-兒茶素(批號P21J11F11 8380)購自上海源葉生物科技有限公司；山奈苷(批號AF21020202)購自成都埃法生物科技有限公司；槲皮苷(批號111538-200302)購于中國藥品生物制品檢定所，化合物純度均大于98%。甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，購于Merck公司。實驗用水為Milli-Q超純水。

桑寄生采集于廣西境內，來源于10個寄主，每個寄主上的桑寄生樣品采集4份，樣品信息見表1。藥材干燥方式為實驗室烘箱干燥，采收后均立即干燥。藥材經南京中醫藥大學藥學院劉訓紅教授鑒定為桑寄生科植物桑寄生Taxilluschinensis(DC.) Danser的帶葉莖枝。留樣憑證保存于南京中醫藥大學中藥鑒定實驗室。

表1 桑寄生藥材樣品信息

續表1(Continued Tab.1)

1.2 測試條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；流動相：甲醇：乙腈(1∶1，A)-水(含0.4%甲酸，B)；梯度洗脫：0～5 min，2%→6% A；5～6 min，6%→10% A；6～8 min，10%→15% A；8～12 min，15%→18% A；12～18 min，18%→21% A；18～21 min，21%→23%A；21～26 min，23%→25% A；26～30 min，25%→27% A；30～33 min，27%→40% A；33～38 min，40%→50% A；38～40 min，50%→2% A；40～45 min，2%→2% A；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL。

1.2.2 質譜條件

電噴霧離子源(ESI)負離子模式；離子源溫度(TEM)600 ℃；噴霧電壓(IS)-4 500 V；脫簇電壓(DP)-100 V；質量掃描范圍50～1 500m/z；氣簾氣壓力(CUR)40 L/min；霧化氣壓力(GS1)60 L/min；輔助氣壓力(GS2)60 L/min。

1.3 溶液的制備

1.3.1 供試品溶液的制備

取桑寄生藥材樣品，粉碎，過50目篩。精密稱定0.5 g，置于具塞錐形瓶中，加入15 mL 50%甲醇，密閉，稱定質量，室溫下超聲提取30 min，放置冷卻，再次稱定質量，用50%甲醇補足失重，過濾，濾液以13 000 r/min離心10 min，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

1.3.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取槲皮素3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、異櫻花素、金絲桃苷、(+)-兒茶素、山奈苷、槲皮苷對照品適量，置于10 mL容量瓶中，加適量70%甲醇，超聲使溶解。再分別精密吸取各對照品溶液適量，加70%甲醇定容至5 mL，配制混合對照品溶液。

1.4 統計分析

將質譜數據導入MarkerView 1.2.1軟件進行峰匹配、峰對齊和濾噪處理，結果進一步導入SIMCA-P 13.0軟件進行分析。首先采用PCA初步觀察各樣品的聚集情況，直觀地表達不同寄主桑寄生的化學組成差異；在主成分分析基礎上，再用PLS-DA對各樣品分類，其中R2X、R2Y越接近1表示模型越穩定，Q2>0.5表示預測率高。根據PLS-DA模型得到的變量權重值(VIP>1)找到潛在的差異化學成分。采用t檢驗驗證多維統計中找到的差異化學成分是否在單維統計中具有顯著性差異，其中P<0.05則表示有顯著性差異。

1.5 差異化學成分的鑒定

通過一級質譜確定精確相對分子質量，二級質譜獲得裂解信息，結合CNKI(https://www.cnki.net/)，SciFinder (https://scifinder.cas.org/)和HMDB(http://www.hmdb.ca/)數據庫搜索、對照品比對及已報道文獻，對VIP>1且P<0.05的差異化學成分進行結構鑒定。共有差異化學成分的量以各樣品對應的峰面積表示，通過對不同寄主桑寄生樣品間同一物質峰面積的平均值和標準差進行計算，得到差異成分在不同寄主樣品間的相對含量變化。

2 結果

2.1 條件的優化

2.1.1 樣品處理方法的優化

供試品溶液的制備中考察了甲醇、80%甲醇、70%甲醇、60%甲醇、50%甲醇、40%甲醇、30%甲醇7種溶劑，結果表明50%甲醇為溶劑時的色譜峰峰型優于其他6種溶劑。同時考察了固液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)和超聲時間(15、30、45、60、75、90 min)，最終結果表明當固液比為1∶30，溶劑為50%甲醇，超聲時間為30 min時得到的相對峰面積較大。

圖1 不同寄主來源桑寄生樣品的UFLC-Triple TOF-MS/MS基峰圖Fig.1 UFLC-Triple TOF-MS/MS base peak chromatogram of Taxilli Herba from different host plants注：圖中編號S1～S10與表1中一致。Note:S1～S10 in Fig.1 were the same as those in Table 1.

2.1.2 色譜、質譜條件的優化

流動相的選擇分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.4%甲酸水、乙腈-0.4%甲酸水，甲醇∶乙腈(1∶1)-0.4%甲酸水及梯度洗脫條件下對樣品中各峰分離度的影響。結果表明，以甲醇：乙腈(1∶1)-0.4%甲酸水溶液為流動相進行梯度洗脫時，各色譜峰具有較好的峰形和分離效果。前期研究發現，桑寄生中主要含有黃酮類和有機酸類化學成分，在負離子模式下有較好的響應，因此選擇負離子模式進行質譜檢測。

根據優化的色譜質譜條件，對不同寄主來源的桑寄生樣品進行UFLC-Triple TOF-MS/MS分析。結果顯示，10個不同寄主來源桑寄生樣品在負離子模式下的基峰圖基本相似，但某些色譜峰的離子強度存在顯著的差異，說明不同寄主來源的桑寄生樣品在化學成分是大致相似的，但在含量上有明顯的區別(見圖1)。

2.2 PCA分析

采用PCA多變量模式識別方法對10個寄主來源的桑寄生樣品進行降維分析。結果顯示，模型驗證結果(R2X= 0.947，Q2= 0.892)表明該模型穩定，預測能力較強。10個寄主桑寄生PCA分析的散點圖(t[1] = 0.636；t[2] = 0.191)示于圖2，可以看出，10個寄主來源的桑寄生樣品各自聚為一類，分類結果較為理想，說明10個寄主的樣品在化學成分的種類和相對含量上存在一定的差異。10個寄主桑寄生相比較，桑樹寄主與其他寄主桑寄生分布距離較遠，表明在化學成分上差異較大，單獨分布在PC1軸負半軸和PC2軸正半軸；大葉冬青、山里紅、雞蛋果和無患子寄主樣品分布在PC1軸正半軸和PC2軸正半軸，四者之間在化學成分上差異較小，同理，柿子樹和黃皮樹寄主的樣品，沙梨、假黃皮和松樹寄主的樣品也分別在化學成分種類和含量上較為相似。

圖2 不同寄主桑寄生在負離子模式下PCA得分圖Fig.2 The principal component analysis (PCA) scores scatter plot of Taxilli Herba from different host plants in negative mode

2.3 PLS-DA分析

PLS-DA作為一種有監督的模式識別方法，在本文中用于確定10個寄主來源桑寄生樣品之間的差異化學成分。本文將目前臨床最為常用的桑樹寄主來源桑寄生樣品與其他9個寄主來源的桑寄生樣品分別進行PLS-DA分析，結果示于圖3，桑樹寄主和其他9個寄主來源的桑寄生樣品沿著PC1軸明顯分開。模型驗證結果(R2Y和Q2)顯示模型有效可靠，對兩組分類貢獻較大的差異性成分(VIP>1)數據列于表2。

2.4 差異化學成分的鑒定與相對定量

通過一級質譜確定精確相對分子質量，二級質譜獲得裂解信息，結合數據庫搜索、對照品比對及已報道文獻，對VIP>1且P<0.05的差異化學成分進行結構鑒定，初步鑒定出19個化學成分，結果見表3。其中4種成分為共有差異成分，分別為(+)-兒茶素、金絲桃苷、槲皮素 3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、槲皮苷。以共有差異化學成分在各樣品中對應的峰面積作為相對含量，得到差異成分在不同寄主樣品間的相對含量變化。如圖4所示，桑樹寄主來源桑寄生樣品中這4種成分的相對含量均高于其他9個寄主，黃皮樹寄主來源的桑寄生排名第二，無患子寄主來源的桑寄生中槲皮素3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和金絲桃苷的相對含量最低。

圖3 桑樹寄主與其他寄主桑寄生樣品的PLS-DA得分圖(a)和VIP>1得分圖(b)Fig.3 PLS-DA scores plot (a) and VIP>1 plot (b) of samples from Morus alba L.and other host plants

表2 不同寄主來源桑寄生樣品PLS-DA分析結果

3 討論與結論

桑寄生在我國具有十分豐富的資源，歷代以桑樹為寄主的桑寄生得到廣泛認同和使用。由于其半寄生性和廣寄性的顯著特征，桑寄生藥材的寄主植物來源復雜多樣，而關于不同寄主來源桑寄生藥材的質量研究多局限于總黃酮含量的測定，未見對不同寄主來源桑寄生化學成分的差異性報道。本實驗基于UFLC-Triple TOF-MS/MS結合多元統計分析技術分析不同寄主來源桑寄生化學成分的差異性，結果表明10個寄主來源桑寄生樣品在PCA模型中的分類效果較為理想，進一步通過PLS-DA分析得到19個差異化學成分，其中(+)-兒茶素、金絲桃苷、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和槲皮苷為共有差異化學成分。桑樹寄主桑寄生中這4種成分的相對含量均高于其他9個寄主，其次為黃皮樹和柿子樹來源的桑寄生，槲皮素3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和金絲桃苷在無患子寄主的桑寄生樣品中最低，為區分不同寄主來源桑寄生提供重要的辨認信息。4種共有差異化學成分均為黃酮類化合物，但在不同寄主來源桑寄生中含量差異明顯，提示寄主是影響桑寄生藥材質量的關鍵因素，至于含量差異引起的臨床療效變化仍待探索。

表3 不同寄主來源桑寄生中差異化學成分的鑒定

圖4 不同寄主來源桑寄生中共有差異化學成分的相對含量變化Fig.4 Relative contents of common differential chemical constituents in Taxilli Herba from different host plants注：a.(+)-兒茶素；b.金絲桃苷；c.槲皮素 3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷；d.槲皮苷。Note:a.(+)-Catechin;b.Hyperoside;c.Quercetin 3-O-β-D-glucuronide;d.Quercitrin.

綜上，本研究借鑒植物代謝組學的研究思路，對10個不同寄主來源桑寄生中化學成分的差異性進行分析，研究結果可為揭示寄主植物對桑寄生代謝產物合成和積累的影響以及探討桑寄生藥材品質形成機制提供基礎資料。