淫羊藿素通過Hedgehog信號通路抑制基底細胞癌細胞生存和遷移

胡文龍，吳平平，劉靈花，劉友饒

九江學院附屬醫院，九江 332000

基底細胞癌約占非黑色素瘤皮膚癌的80%，是全球最常見的癌癥[1]。大多數基底細胞癌可以通過手術治愈，但對于晚期或進展性基底細胞癌，手術和/或放療則顯得力不從心，甚至可能造成明顯的功能或外形的喪失。雖然鉑類化療藥物具有顯著的抗腫瘤活性，但對患者的生存率卻無明顯改變[2]。因此，尋求一種新的能改善基底細胞癌預后的治療方法已十分必要。基底細胞癌來源于濾泡間表皮或毛囊的基底角質細胞[3,4]，在95%的散發性基底細胞癌中，刺猬(Hedgehog，Hh)信號通路均出現異常激活[5]。大量研究數據證明，Hh信號通路抑制劑對難治性以及不適合手術或放療的基底細胞癌患者是非常有效的治療選擇，但同時由于藥物不良事件的出現而停止治療也很常見[6]。因此，開發一種新型的安全有效的Hh信號通路抑制劑將顯著改善目前和未來基底細胞癌的治療前景。淫羊藿素(icaritin)是小檗科淫羊藿屬植物淫羊藿的主要活性單體成分。近年來，淫羊藿素的抗腫瘤作用已得到廣泛研究，能通過不同信號通路和細胞靶點抑制宮頸癌[7]、食管癌[8]、黑色素瘤[9,10]等多種惡性腫瘤活性，其中Hh信號通路在淫羊藿素抑制食管癌干細胞的增殖、遷移和侵襲的過程中發揮了重要作用[8]。本研究將著重探討淫羊藿素的抗基底細胞癌活性及其與Hh信號通路的關系，以期為基底細胞癌的治療提供新的潛在藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

人皮膚基底細胞癌A431細胞株為九江學院附屬醫院實驗室饋贈；淫羊藿素38226-86-7(成都格利普生物科技有限公司，純度98.5%)用DMSO溶解后配制成320 mmol/L母液；GANT 61500579-04-4(MedChemExpress公司)；胰蛋白酶-EDTA消化液、DMEM高糖培養基、胎牛血清(Gibco公司，批號分別為：25300-054、C11995500BT、10091148)；兔抗人Hedgehog、Smo、Gli1、Bcl-2、Bax、MMP-9抗體(Abcam公司，批號分別為：ab53281、ab5694、ab134906、ab32134、ab32503、ab76003)；GREENspin細胞RNA快速提取試劑盒、CCK-8試劑盒(上海經科化學科技有限公司，批號分別為：hz-409-1、JK-021)；Caspase-3活性測定試劑盒(Solarbio科技有限公司，批號：BC3830)；Go Script逆轉錄試劑盒、Go Taq qPCR Master Mix(Promega公司，批號分別為：A5003、A6001)；25 cm2塑料培養瓶、6孔、96孔、Transwell培養板(美國Corning公司)；倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司)；酶標儀-Model680(美國BIO-RAD公司)；化學發光成像分析系統、CO2恒溫培養箱(Eppendorf公司)。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8檢測細胞活力

取對數生長期A431細胞1×104個/孔接種于96孔培養板，常規培養24 h后加藥。實驗設0、10、20、40、80、160 μmol/L 6個濃度梯度，空白對照組(control，Con)給予含0. 05% DMSO的完全培養基，各組均常規設置8個副孔和2個藥物對照(含同組相同濃度藥物培養基而不含細胞)孔。分別于作用24 h、48 h、72 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑，酶標儀測定其450 nm處吸光度A值，以藥物對照孔進行調零，計算細胞活力：細胞活力=(A實驗/A對照)× 100%。

1.2.2 Transwell遷移實驗

A431細胞按1×105/孔接種于6孔板，隨機分組培養。A分組法分為對照組(0 μmol/L)、40 μmol/L組和80 μmol/L組，分別加入相應濃度淫羊藿素預處理24 h。B分組法分為對照組(0 μmol/L)、GANT 61組(10 μmol/L)和GANT 61(10 μmol/L)+Icaritin(80 μmol/L)組，分別加入相應濃度GANT 61和/或淫羊藿素預處理24 h。按以上方法分組培養后常規消化離心，無血清培養基調整細胞密度為1×106個/mL，上室每孔加入相應100 μL細胞懸液，下室均加入600 μL含5%胎牛血清的完全培養基。培養12 h后結晶紫染色，隨機選取5個高倍鏡視野進行計數。對上室底膜上下室側附著的細胞進行直接計數。

1.2.3 Caspase-3活性檢測

取生長良好的細胞按1×106/孔接種于6孔培養板，待細胞完全貼壁后同A方法分組培養，每組設4個復孔，培養24 h后按Caspase-3活性測定試劑盒說明操作，酶標儀檢測各組樣品405 nm波長處吸光度，計算Caspase-3活性。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡

將對數生長期的A431細胞常規接種于6孔板后同A方法分組培養24 h，收集各組細胞，調整細胞密度為1×106個/mL，取1 mL細胞懸液用預冷PBS洗滌離心2遍，先后加入200 μL Binding Buffer、10 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，室溫避光反應15 min后加入300 μL Binding Buffer，流式細胞儀定量檢測細胞凋亡率。

1.2.5 qPCR檢測mRNA表達水平

同“1.2.2”方法分組培養24 h后，按GREENspin細胞RNA快速提取試劑盒、Go Script逆轉錄試劑盒說明書提取細胞總RNA，逆轉錄為cDNA，按Go Taq qPCR Master Mix配制反應體系進行PCR擴增。引物序列及產物大小見表1。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達水平

分組培養48 h后提取各組細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，進行SDS-PAGE凝膠電泳，依次進行轉膜、封閉，孵育一抗、二抗，采用化學發光成像系統觀察分析條帶。內參為GAPDH，目的蛋白包括Hedgehog、Smo、Gli1、Bcl-2、Bax和MMP-9。

表1 引物序列和產物大小

1.2.7 統計學處理

2 結果

2.1 淫羊藿素抑制A431細胞活力

CCK-8結果顯示，不同濃度的淫羊藿素均能抑制基底細胞癌A431細胞增殖，造成細胞活力下降，藥物濃度越高，抑制作用越強；同一濃度下，細胞活力隨作用時間延長而下降。80 μmol/L的淫羊藿素作用48 h時抑制作用開始進入平臺期，再增加作用濃度和時間，細胞活力下降不明顯(見圖1)。以上實驗結果表明，80 μmol/L的淫羊藿素具有強大的抑制A431細胞活性的作用。計算得IC50=54.78 μmol/L，因此，后續實驗均參考該實驗結果設40 μmol/L和80 μmol/L兩個濃度作為實驗組，作用時間為24 h。

2.2 淫羊藿素抑制A431細胞遷移

Transwell遷移實驗發現，淫羊藿素作用24 h后對基底細胞癌A431細胞的遷移能力具有明顯的抑制作用(P<0.05)，40 μmol/L組的抑制率可達約68.9%，而80 μmol/L組的抑制率高達91.1%，呈現出濃度依賴性(見圖2)。

圖1 CCK-8檢測細胞活力Fig.1 Cell viability assay by CCK-8

2.3 淫羊藿素增強A431細胞Caspase-3活性誘導細胞凋亡

淫羊藿素(40、80 μmol/L)作用的A431細胞Caspase-3活性明顯增強(P<0.05)，且活性隨濃度升高而增高(見圖3)。進一步的流式細胞術結果顯示，40 μmol/L和80 μmol/L組A431細胞的凋亡率分別為15.42%和42.87%，對照組凋亡率為2.21%，不同濃度的淫羊藿素均具有誘導基底細胞癌細胞凋亡的作用(P<0.05)，且80 μmol/L較40 μmol/L的淫羊藿素促凋亡作用更強(見圖4)。

2.4 淫羊藿素對Hh信號通路及凋亡、遷移相關基因轉錄及蛋白表達的影響

qPCR結果顯示：與對照組相比，40 μmol/L和80 μmol/L的淫羊藿素均能下調Shh、Smo、Gli1、Bcl-2和MMP-9的轉錄水平(P<0.05)，且高濃度的抑制作用更強，而促凋亡基因Bax的mRNA水平則明顯增強(P<0.05)(見圖5)。Western blot與qPCR結果一致，淫羊藿素能夠抑制Hh信號通路相關因子及MMP-9蛋白的表達，促進凋亡因子Bax的表達同時抑制抗凋亡因子Bcl-2(見圖6)。以上結果表明，淫羊藿素能夠抑制Hh信號通路，啟動細胞凋亡程序。

圖2 淫羊藿素抑制A431細胞遷移Fig.2 Icaritin inhibited the migration of A431 cells注：與空白對照組比較，*P<0.05；與40 μmol/L組比較，#P<0.05。Note:Compared with control group,*P<0.05;Compared with 40 μmol/L,#P<0.05.

圖3 不同濃度淫羊藿素對A431細胞caspase-3活性的影響Fig.3 Effects of icaritin at different concentrations on Caspase-3 activity in A431 cells注：與對照組比較，*P<0.05；與40 μmol/L組比較，#P<0.05。Note:Compared with control group,*P<0.05;Compared with 40 μmol/L,#P<0.05.

2.5 淫羊藿素主要通過抑制Hh信號通路上調凋亡相關因子并下調遷移相關因子的表達

GANT 61是Hh信號通路Gli1和Gli2的靶向抑制劑，Western blot結果也表明GANT 61具有強大的抑制Gli1表達的作用。GANT 61能明顯上調Bax的表達，同時下調Bcl-2與MMP-9的表達(P<0.05)，而使用GANT 61抑制Hh信號通路后，淫羊藿素對Bcl-2、BAX的表達均不能產生明顯影響，對MMP-9則仍具有一定的抑制作用(P<0.05)(見圖7)。

2.6 淫羊藿素通過抑制Hh信號通路介導基底細胞癌細胞凋亡

Caspase-3細胞活性檢測表明使用GANT 61抑制Hh信號通路后，A431細胞Caspase-3活性明顯增加(P<0.05)，而淫羊藿素并不能進一步介導細胞凋亡(見圖8)。

2.7 淫羊藿素通過抑制Hh信號通路抑制基底細胞癌細胞遷移

Transwell遷移實驗結果顯示，Hh信號通路被抑制后(GANT 61)，A431細胞細胞遷移能力明顯下降(P<0.05)，而淫羊藿素未能加強抑制細胞遷移的作用(見圖9)。

3 討論與結論

Hh信號通路參與了腫瘤組織的啟動、遷移和凋亡等多種生物學行為，與多達三分之一的惡性腫瘤的形成、發展有關[11]。Hedgehog蛋白在脊椎動物中至少有音速刺猬因子(sonic hedgehog，Shh)、印度刺猬因子(india hedgehog，Ihh)和沙漠刺猬因子(desert hedgehog，Dhh)三個基因編碼，其中Shh在皮膚、神經系統和消化道中廣泛表達，作用于Patched(Ptc)和Smothened(Smo)兩種細胞膜受體。在正常生理狀態下，Hh配體常常缺失，Ptc與Smo結合，抑制Smo蛋白活性，進而阻止下游膠質瘤相關癌基因(glioma-associated oncogene，Gli)轉錄因子(Gli1、GliI2和Gli3)向核內轉移。當Hh蛋白和Ptc結合以后，解除了對Smo的抑制，可使全長Gli蛋白進入核內并激活下游靶基因轉錄[11,12]。研究表明，高達95%的基底細胞癌均出現Hh信號通路異常激活，其中約67%表現為Ptc缺失，10%表現為Smo突變[13-15]，導致Gli進入細胞核并促進細胞分裂和腫瘤形成[13]。因此，靶向抑制Hh信號通路將可能有效抑制基底細胞癌的發展，而對正常組織細胞無明顯影響。

圖4 流式細胞術比較不同濃度淫羊藿素對A431細胞凋亡率的影響Fig.4 Comparison of the effect of icaritin at different concentrations on apoptosis rate in A431 cells by flow cytometry注：與對照組比較，*P<0.05；與40 μmol/L組比較，#P<0.05。Note:Compared with control group,*P<0.05;Compared with 40 μmol/L,#P<0.05.

圖5 Hedgehog、Smo、Gli1、Bcl-2、MMP-9和Bax的mRNA表達水平Fig.5 The mRNA expression levels of Hedgehog,Smo,Gli1,Bcl-2,MMP-9 and Bax注：與對照組比較，*P<0.05；與40 μmol/L組比較，#P<0.05。Note:Compared with control group,*P<0.05;Compared with 40 μmol/L,#P<0.05.

淫羊藿是在亞洲傳統醫學中常被用作滋補藥、壯陽藥，具有廣泛的治療能力。大量體內、外研究表明淫羊藿素具有廣泛的抗腫瘤活性，通過凋亡、細胞周期調節、抗血管生成、抗轉移和免疫調節等多種機制發揮作用[16]。其中，抑制Hh信號通路是淫羊藿素抑制食管癌細胞的主要作用機制[8]。本研究發現淫羊藿素具有廣泛地抑制基底細胞癌A431細胞Hh信號通路相關因子(Hedgehog、Smo、Gli1)的作用，同時能夠介導細胞凋亡并抑制其遷移。這表明，淫羊藿素可能通過抑制Hh信號通路發揮抗基底細胞癌的作用。

Gli是Hh信號通路的核心成員，其調控的下游靶基因包括通路本身成員Ptch1、Ptch2、Gli1和腫瘤細胞凋亡調控因子(Bcl-2)、細胞周期調控因子(CCND2)、細胞轉移相關因子等[11]。MMP-9是目前研究最廣泛的基質金屬蛋白酶之一，可裂解多種細胞外基質蛋白，調節細胞外基質的重構，與腫瘤的侵襲、轉移和血管生成等密切相關[17]，在肝癌[18]、口腔鱗狀細胞癌[19]、神經母細胞瘤[20]等腫瘤中高表達并與Hh信號通路密切相關。為了進一步闡明淫羊藿素抑制A431細胞的作用與Hh信號通路的關系，本研究使用GANT 61抑制Gli從而達到封閉Hh信號通路的作用，結果發現Gli1、Bcl-2、MMP-9表達明顯下調而Bax明顯上調，并出現細胞凋亡增加和遷移抑制，淫羊藿素具有調控以上細胞因子和行為的同樣作用，但當Hh信號通路被抑制后，淫羊藿素則失去了對Bcl-2、Bax的調控作用，僅僅輕度增強了對MMP-9的抑制作用，細胞凋亡和遷移也未出現明顯變化，說明淫羊藿素并未通過其他信號通路明顯作用于A431細胞，但其對MMP-9的調控可能存在其他信號通路，仍有待進一步研究。因此，可以認為淫羊藿素可能主要通過抑制Hh信號通路，促進凋亡相關因子的表達，介導基底細胞癌細胞凋亡，同時下調MMP-9的表達，抑制基底細胞癌細胞的遷移。

圖6 Hedgehog、Smo、Gli1、Bcl-2、Bax和MMP-9的蛋白表達水平Fig.6 The protein expression levels of Hedgehog,Smo,Gli1,Bcl-2,Bax and MMP-9注：與對照組比較，*P<0.05；與40 μmol/L組比較，#P<0.05。Note:Compared with control group,*P<0.05;Compared with 40 μmol/L,#P<0.05.

圖7 GANT 61和/或淫羊藿素作用A431細胞后Gli1、Bcl-2、Bax和MMP-9的蛋白表達水平Fig.7 Changes in Gli1,Bcl-2,Bax and MMP-9 protein levels of A431 cells incubated with GANT 61 and/or icaritin注：與對照組比較，*P<0.05；與GANT 61組比較，#P<0.05。Note:Compared with control group,*P<0.05;Compared with 40 μmol/L,#P<0.05.

圖8 GANT 61和/或淫羊藿素對A431細胞Caspase-3活性的影響Fig.8 Effects of GANT 61 and/or icaritin on Caspase-3 activity in A431 cells注：與對照組比較，*P<0.05；與GANT 61組比較，#P<0.05。Note:Compared with control group,*P<0.05;Compared with GANT 61,#P<0.05.

圖9 GANT 61和/或淫羊藿素對A431細胞遷移的影響Fig.9 Effects of GANT 61 and/or icaritin on A431 cells migration注：與對照組比較，*P<0.05；與GANT 61組比較，#P<0.05。Note:Compared with control group,*P<0.05;Compared with GANT 61,#P<0.05.

綜上，本研究表明淫羊藿素能通過抑制Hh信號通路抑制基底細胞癌細胞的生存和遷移能力，為其作為靶向藥物或者輔助治療藥物治療基底細胞癌提供了新的思路和方案。