加味桂枝茯苓丸治療前列腺增生癥的網絡藥理學及實驗研究

劉 丹，陳亞飛，劉柘君，唐 田，于淑俊，劉桂敏，湯軼波*，劉振權*

1北京中醫藥大學中藥學院；2北京中醫藥大學中醫學院，北京 100029

良性前列腺增生癥(benign prostatic hyperplasia，BPH)簡稱前列腺增生癥，臨床發病群體多為中老年男性，據統計，BPH發病率隨年齡增長而增加，80歲時達80%，且數據仍在逐年遞增[1]。BPH的治療手段有西藥和手術治療，但西藥療法會對神經認知和性功能造成損傷，外科手術則伴隨術后并發癥，所以探索BPH新的治療途徑刻不容緩。

中醫講究整體觀和辨證論治，在疾病治療上有豐富經驗和獨特優勢。桂枝茯苓丸出自漢代醫圣張仲景，本研究中的加味桂枝茯苓丸(modified Guizhi Fuling Pill，MGFP)由桂枝、茯苓、桃仁、牡丹皮、赤芍、王不留行、烏藥、水蛭8味中藥組成，是課題組前期基于數據挖掘提取出的國醫大師王琦院士治療BPH的核心組方[2]。根據中醫理論，BPH的發病病機是“腎氣虧虛、瘀血阻滯”，MGFP善散瘀血、消癥積、通水道，臨床使用有顯著療效，但中藥復方成分復雜，對其作用機制研究造成極大阻礙。

近年來，網絡藥理學廣泛用于中藥藥理學的研究，其理念圍繞有效藥物治療疾病以相互連接網絡中的多個分子為靶點，這恰好與中藥的多成分、多靶點、多途徑理論相契合。基于此，本研究利用網絡藥理學和分子對接技術探討MGFP對BPH的潛在作用機制，并建立BPH模型大鼠對其中結合能最優的靶點進行驗證，以期為臨床治療提供數據支撐。

1 MGFP治療BPH的網絡藥理學研究

1.1 MGFP相關靶點篩選

1.1.1 植物藥相關靶點篩選

通過TCMSP數據庫(https://tcmspw.com/tcmsp.php)、TCMID數據庫(http://119.3.41.228:8000/tcmid/)尋找桂枝、茯苓、桃仁、牡丹皮、赤芍、王不留行、烏藥7味植物類中藥的化學成分。利用口服利用度(oral bioavailability，OB)≥ 30%及類藥性(drug-likeness，DL)≥ 0.18兩個ADME屬性值對候選成分進行初步篩選。在PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載候選化合物二維構象的sdf格式文件，再導入PharmMapper數據庫(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)進行潛在靶點的預測，并將“normalized fit score”排前10的靶點確定為最終結果。篩選結束后，將所有靶點剔除重復值，利用UniProt蛋白質數據庫(https://www.uniprot.org)對上述靶點信息進行標準化處理。

1.1.2 動物藥相關靶點篩選

由于水蛭是動物藥，無法在TCMSP數據庫中檢索到，故通過國內外相關文獻[3,4]搜索其候選成分。參照“1.1.1”項，在PubChem、PharmMapper中篩選潛在靶點，并對靶點信息進行規范化命名。

1.2 BPH相關靶點篩選

選擇“prostatic hyperplasia”“benign prostatic hyperplasia”等與BPH相關的疾病作為關鍵詞，挖掘GeneCards數據庫(https://www.genecards.org)、OMIM數據庫(http://www.omim.org)、TTD數據庫(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)、DisGeNET數據庫(https://www.disgenet.org/)以及DRUGBANK數據庫(https://www.drugbank.ca)中BPH的潛在靶點。由于GeneCards數據庫靶點過多，而該數據庫中score值越高代表此靶點與疾病聯系越密切，根據經驗，設定score值≥中位數的目標靶點為BPH的潛在靶點，合并5個疾病數據庫靶點后，刪除重復值得到BPH最終靶點。

1.3 構建藥物候選成分目標網絡

將8味藥篩選出的候選成分與靶點基因導入Cytoscape 3.7.1，利用插件Network Analyzer計算degree值，并構建MGFP藥物-候選成分-靶點的網絡圖。

1.4 MGFP成分-BPH靶點PPI網絡構建

提取MGFP成分與BPH疾病的交集靶點，并通過在線作圖工具Draw Venn Diagram網站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)繪制韋恩圖。再將交集靶點導入STRING 11.0平臺(https://string-db.org/)分析靶點基因間的相互作用關系，最后將數據導入Cytoscape 3.7.1軟件建立蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡圖。

1.5 GO功能注釋和KEGG通路富集分析

將“1.4”MGFP與BPH的交集靶點導入Metascape(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)數據庫及KOBAS 3.0(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3)數據庫[5]，分別進行GO細胞組成(cellular component，CC)富集分析、生物過程(biological process，BP)富集分析、分子功能(molecular function，MF)富集分析及KEGG富集分析，并在Cytoscape 3.7.1軟件中構建“成分-靶點-通路”網絡圖。

1.6 分子對接驗證

選取“成分-靶點-通路”網絡中degree值排名前5的MGFP核心成分與BPH關鍵靶點進行分子對接。具體操作如下：(1)制備小分子配體：首先從TCMSP數據庫下載MGFP核心成分的.mol2格式文件，再利用AutodockTools加氫、設為配體、確定扭矩中心、選擇扭轉鍵，導出為.pdbqt格式。(2)制備受體分子：蛋白質的晶體結構來自RCSB PDB網站(http://www.rcsb.org/)，選擇具有一種或多種共結晶配體及低“分辨率”值晶體結構的人類蛋白，保存為.pdb格式，利用AutoDockTools去水加氫，設為受體并導出為.pdbqt格式。(3)分子對接：AutoDock是一款基于模擬退火和遺傳算法實現受體分子和配體盲對接的工具，盲對接是高通量篩選和反向對接的關鍵部分，可以發現受體和配體的最佳結合位置與構象，用半經驗的自由能計算方法來評價兩者的匹配情況[6]。通過AutoDock 4.2.6軟件調整Grid Box參數直至盒子將受體分子全部包裹住，采用盲對接的方法尋找活性位點，導出格點參數文件(GPF)，運行Autogrid4，設置對接參數及算法進行半柔性對接，運行Autodock4，查看結果。(4)利用PyMOL 2.2.0軟件將對接結果可視化處理。

2 MGFP治療BPH的動物實驗驗證

2.1 藥物與試劑

MGFP劑量參照王琦院士臨床用藥經驗，由桂枝10 g、茯苓10 g、桃仁9 g、牡丹皮10 g、赤芍10 g、王不留行20 g、烏藥20 g、水蛭3 g組成，購自北京同仁堂股份有限公司新悅都店。玉米油購自中糧福臨門食品營銷有限公司(批號：Q/02A3097S)；丙酸睪酮注射液購自寧波第二激素廠(批號：200801)；非那雄胺片購自浙江仙琚制藥股份有限公司(批號：201207)；癃閉舒膠囊購自石家莊科迪藥業有限公司(批號：J2011201)；兔抗BAX購自美國Cell Signaling Technology公司(批號：14796S)；免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋公司(批號：SP-9001)。

2.2 動物

選用SPF級健康成年雄性SD大鼠48只，體質量200～220 g，購自維通利華實驗動物技術有限公司，大鼠飼養于溫度23～25 ℃、濕度50%±10%的環境中，照明時間為12 h/d，自由飲水和進食，在新環境適應性飼養7 d后開始實驗。

2.3 儀器

旋轉蒸發儀(瑞士BUCHI，R-220PRO)；熒光倒置生物顯微鏡(日本NIKON，TS-2)；電熱鼓風干燥箱(上海申光儀器儀表有限公司，101AB-1)；石蠟切片機(德國萊卡，LEICA-RM2165)。

2.4 分組及給藥

SD大鼠適應性飼養7天后，隨機選取6只為空白組，6只為假手術組，空白組大鼠不做手術處理，假手術組大鼠打開陰囊后擠出睪丸再放回縫合，其余36只大鼠隨機分為模型組、MGFP低、中、高劑量組、非那雄胺組以及癃閉舒膠囊組，每組6只，均采用去勢手術聯合丙酸睪酮注射建立BPH模型。操作方法：先用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，常規消毒后打開陰囊，擠出睪丸，小心剝離脂肪組織后摘除雙側睪丸，在傷口處撒入適量青霉素固體粉末防止感染，然后結扎止血縫合。術后讓大鼠恢復7天，選取去勢后狀態良好的大鼠，皮下注射丙酸睪酮5 mg/kg(丙酸睪酮溶解于玉米油中)，1次/天，空白組和假手術組皮下注射等體積玉米油，連續28天。BPH大鼠模型建立成功后開始給藥治療，MGFP低、中、高劑量組分別灌胃6.57、13.14、26.28 g/kg(相當于臨床給藥劑量的5、10、20倍)，非那雄胺組灌胃0.71 mg/kg，癃閉舒膠囊組灌胃0.257 g/kg，空白組、假手術組及模型組灌胃等量蒸餾水，1次/天，連續28天。實驗期間，每3天稱重一次，根據大鼠體重變化調節給藥劑量。

2.5 取材

末次給藥后24 h，水合氯醛麻醉，剖開大鼠腹部充分暴露腹腔內臟器，找到大鼠膀胱，前列腺與膀胱相連，位于膀胱背側，將前列腺與膀胱一同剪取，然后小心分離摘取前列腺，用濾紙吸去多余水分，然后置于4%多聚甲醛固定，用于后續檢測。

2.6 免疫組化法檢測大鼠前列腺組織中BAX蛋白的表達

固定24 h后，將上述前列腺組織從4%多聚甲醛溶液中取出，依次進行修塊、常規乙醇脫水、石蠟包埋、切片(5 μm)、烤片、脫蠟至水操作。蒸餾水中清洗2次，每次5 min；滴加內源性過氧化物酶阻斷劑15 min，洗滌；浸入檸檬酸鈉抗原修復液并置于微波爐95 ℃加熱5 min，進行抗原修復，自然冷卻，洗滌；滴加5%山羊血清，室溫封閉30 min，甩除免洗；滴加一抗工作液(1∶400)，4 ℃孵育過夜，洗滌；滴加二抗辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG，室溫孵育15 min，洗滌；再依次進行DAB顯色、蘇木精復染、脫水、透明、封片、晾干并置于顯微鏡下觀察并采集圖像。用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統測定BAX，BAX的平均光密度值(average optical density，AOD)=累積光密度值(integrated optical density，IOD)/陽性表達面積，AOD值越大表示BAX蛋白表達水平越高。

2.7 統計分析

3 結果

3.1 MGFP候選成分及其靶點信息

檢索出MGFP化學成分共計713種，包括桂枝224種、茯苓34種、桃仁66種、牡丹皮55種、赤芍119種、王不留行26種、烏藥128種、水蛭61種。經“1.1.1”篩選后，最終得到MGFP的候選成分共計133種，包括桂枝7種、茯苓11種、桃仁19種、牡丹皮6種、赤芍18種、王不留行4種、烏藥9種、水蛭59種，刪除重復值后得MGFP成分靶點317個。MGFP候選成分的基本信息見表1。

表1 MGFP候選成分

續表1(Continued Tab.1)

續表1(Continued Tab.1)

續表1(Continued Tab.1)

3.2 BPH相關靶點

通過檢索GeneCards、OMIM、TTD、DisGeNET以及DRUGBANK五大疾病數據庫中BPH的相關靶點，合并、刪除重復值后，共獲取到BPH的疾病靶點3 026個。

3.3 MGFP藥物-候選成分-靶點網絡圖

將MGFP所含8味中藥、133種候選成分以及靶點信息導入Cytoscape 3.7.1進行可視化分析，藥物-候選成分-靶點網絡圖由448個節點和1 825條邊組成(見圖1)。結果顯示，degree值較高的成分是F1(槲皮素)、A1(β-谷甾醇)、D1(豆甾醇)、MDP2(山奈酚)和E1(常春藤皂苷元)，表明其可能是MGFP治療BPH的主要成分，而degree值較高的靶點是PTGS2、CA2、NCOA2、PTGS1、PGR、BMP2、MAOB、GABRA1、PIM1、CDK2，表明MGFP治療BPH將通過調控多個靶點來發揮作用。

3.4 MGFP成分-BPH靶點PPI網絡構建

將篩選后的317個MGFP成分靶點與3 026個BPH疾病靶點取交集，并通過Draw Venn Diagram網站繪制韋恩圖，最終得到交集靶點212個(見圖2)。將交集靶點導入STRING 11.0平臺，設置置信度為medium confidence 0.400，獲取PPI網絡圖的TSV文件，輸入Cytoscape 3.7.1，并利用Bisogenet 3.0.0插件在線檢索蛋白質相互作用數據庫，構建成分疾病的交集靶點PPI網絡(見圖3)。網絡A由211個節點、4 272條邊組成，說明交集靶點基因之間存在復雜的相互作用關系，網絡B、C分別通過度中心性(degree centrality，DC)≥32、DC≥59篩選核心網絡，最終的核心網絡C由54個節點、1 233條邊組成。根據degree值降序排列，54個核心靶點分別為AKT1、ALB、TP53、IL6、VEGFA、TNF、EGFR、EGF、JUN、MMP9、MYC、CASP3、MAPK1、SRC、MAPK8、ESR1、PTGS2、CXCL8、CCND1、PTEN、FOS、IL1B、HSP90AA1、MMP2、CCL2、IL10、ERBB2、MAPK14、CAT、ANXA5、NOS3、AR、SERPINE1、BCL2L1、ICAM1、PPARG、CYCS、SPP1、RELA、IL2、CASP8、STAT1、HMOX1、VCAM1、TGFB1、KDR、CDKN1A、PLG、HIF1A、CAV1、IFNG、MMP1、MPO、CASP9。

圖1 MGFP藥物-候選成分-靶點網絡圖Fig.1 Network diagram of MGFP herbs-candidate components-targets注：圓形節點代表中藥；六邊形節點代表候選成分；菱形節點代表靶點。Note:Circular node represents the herb;Hexagonal node represents candidate component;Rhombic node represents target.

圖2 MGFP成分靶點與BPH疾病靶點韋恩圖Fig.2 Venn diagram of the intersection targets of MGFP component and BPH disease

圖3 MGFP-BPH核心靶點的篩選圖Fig.3 Screening diagram of MGFP-BPH core targets注：A有211個節點和4 272條邊；B有106個節點和2 825條邊；C有54個節點和1 233條邊。Note:A contains 211 nodes and 4 272 edges;B contains 106 nodes and 2 825 edges;C contains 54 nodes and 1 233 edges.

3.5 GO功能注釋和KEGG通路富集分析

將212個交集靶點導入Metascape數據庫，依次選擇GO-CC、GO-BP、GO-MF進行GO功能富集分析，設置P<0.01，count≥3，最終分別得到100、2 489、186條信息。篩選P排名最小的前20條GO生物功能信息，將相關數據導入微生信網站(http://www.bioinformatics.com.cn/)繪制GO生物功能氣泡圖(見圖4)。圖中氣泡顏色越紅越亮表示靶點的P越小，即富集越顯著，氣泡面積越大表示靶點數越多。結果顯示，MGFP主要參與的生物學進程顯著性富集于血管生長相關過程、氧化應激相關過程、凋亡相關過程、凝血相關過程及免疫相關過程，見圖4B。其中血管生長相關過程包括脈管系統發育進程(vasculature development)、心血管系統發育進程(cardiovascular system development)、血管發育進程(blood vessel development)、血管形態發生(blood vessel morphogenesis)；氧化應激相關過程包括對無機物的應答(response to inorganic substance)、活性氧代謝進程(reactive oxygen species metabolic process)、對活性氧的應答(response to reactive oxygen species)、細胞氧化應激應答(cellular response to oxidative stress)。另外，在GO-BP的富集過程中，利用MCODE算法挖掘出三個核心子模塊，具體富集分析結果見表2。

相關靶點調控BPH的功能則主要富集于轉錄因子結合(transcription factor binding)、核受體活性(nuclear receptor activity)、蛋白激酶活性(protein kinase activity)、細胞因子受體結合(cytokine receptor binding)、腎上腺素能受體活性(adrenergic receptor activity)、RNA聚合酶II轉錄因子結合(RNA polymerase II transcription factor binding)等(見圖4C)，由此可見，多個靶點的功能與BPH的發生機制密不可分[7]。

將212個交集靶點導入KOBAS 3.0數據庫，選擇KEGG進行富集分析，得到254條通路，其中P>0.001的通路有172條。運用KOBAS 3.0數據庫進行可視化分析，繪制出KEGG信號通路水平柱狀圖(見圖5)。圖5A每個節點表示一個富集項，每條邊表示兩個富集項之間的連接，圖中顯示出兩個富集項的基因重疊比率大于特定界限值(默認值>0.35)的8個cluster，不同顏色的cluster代表結構網絡中特定拓撲社區的節點。圖5B縱軸表示MGFP治療BPH的相關KEGG通路，橫軸表示富集率，計算方式為“輸入靶點數/背景靶點數”，圖5B條狀圖的顏色與圖5A的8個cluster對應，條形長度越長代表富集率越高，每個cluster顯示富集率最高的5條KEGG通路。KEGG分析結果表明，MGFP可能通過糖尿病并發癥AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、PI3K-AKT信號通路(PI3K-AKT signaling pathway)、細胞凋亡(apoptosis/apoptosis-multiple species)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、Th17細胞分化(Th17 cell differentiation)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、VEGF信號通路(VEGF signaling pathway)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、Ras信號通路(Ras signaling pathway)、Rap1信號通路(Rap1 signaling pathway)等信號通路在治療BPH中發揮作用，交集靶點在PI3K-AKT信號通路中的情況見圖6[8]。

圖4 GO功能注釋富集分析Fig.4 GO function annotation enrichment analysis注：A：細胞組成分析；B：生物過程分析；C：分子功能分析。Note:A:Cellular component analysis;B:Biological process analysis;C:Molecular function analysis.

表2 子模塊GO-BP富集分析基本信息(Top3)

圖5 KEGG信號通路富集分析Fig.5 KEGG signaling pathway enrichment analysis注：A：KEGG信號通路模塊富集網絡圖；B：KEGG通路分析水平柱狀圖。Note:A:Module enrichment network diagram of KEGG signaling pathway;B:Histogram of KEGG pathway enrichment analysis.

圖6 MGFP-BPH的交集靶點在PI3K-AKT信號通路中的情況Fig.6 The intersection targets of MGFP-BPH in PI3K-AKT signaling pathway注：紅色矩形代表MGFP-BPH的交集靶點；綠色矩形代表通路中的基礎靶點。Note:Red rectangle represents the intersection targets of MGFP-BPH;Green rectangle represents the basic targets in the pathway.

圖7 MGFP治療BPH的“成分-靶點-通路”網絡圖Fig.7 Network diagram of “component-target-pathway” of MGFP in the treatment of BPH注：藍色方形代表靶點；綠色圓形代表主要候選成分；紅色V形代表通路。Note:Blue square represents the target;Green circle represents the main candidate component;Red V-shape represents the pathway.

此外，利用KOBAS 3.0分析結果中的核心通路反向匹配出相應靶點和成分，并將相關信息導入Cytoscape 3.7.1構建“成分-靶點-通路”網絡圖(見圖7)。結果顯示，槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、黃芩素、鞣花酸五種化合物及MAPK1、CASP3、RELA、CASP9、AKT1、BAX、BCL2、PRKCA、TP53、JUN、TGFB1、CASP8、TNF、IL6、VEGFA、EGFR、MAPK8、CHUK、MAPK14、CDKN1A 20個靶點的degree值處于較高水平，參照文獻發現AKT1、BAX、BCL2、JUN、TGFB1、TNF、IL6、VEGFA、EGFR是與BPH發病機制密切相關的靶點，該結果也與“3.4”中PPI網絡中篩選出的核心靶點相符，故選取上述5種核心成分、9個關鍵靶點用于后續分子對接。

3.6 MGFP核心成分與關鍵靶點分子對接

下載MGFP核心成分槲皮素(MOL000098)、β-谷甾醇(MOL000358)、山奈酚(MOL000422)、黃芩素(MOL002714)、鞣花酸(MOL001002)與關鍵靶點蛋白AKT1(PDBID：4EJN)、BAX(PDBID：3WZE)、BCL2(PDBID：5IF4)、JUN(PDBID：3OY1)、TGFB1(PDBID：5VQP)、TNF(PDBID：2AZ5)、IL6(PDBID：1ALU)、VEGFA(PDBID：5HHC)、EGFR(PDBID：5CAS)的相關文件，使用AutoDock 4.2.6軟件進行分子對接，結果見表3。以結合能為參考指標，活性分子與靶點蛋白的最低結合能< 0，說明配體與受體均可自發結合，而結合能越小，二者間的結合能力越強。本研究選取結合能≤ -20 929 J/mol作為篩選依據，其中AKT1、BAX、JUN、TNF、VEGFA靶點與5種核心成分對接結果良好，表明相互間結合能力較優，潛在生物活性高。

以對接結果最好的BAX與β-谷甾醇為例，兩者間結合能為-37 966 J/mol，受體蛋白BAX與β-谷甾醇配體小分子之間的結合模式見圖8。其中氨基酸殘基GLU-815與β-谷甾醇配體小分子形成氫鍵相互作用，氫鍵長度為0.19 nm。

表3 MGFP核心成分與關鍵靶點的分子對接結合能

圖8 BAX和β-谷甾醇的分子對接示意圖Fig.8 Molecular docking diagram of BAX and β-sitosterol

3.7 MGFP對BPH模型大鼠前列腺組織中BAX蛋白表達的影響

圖9所示為各組大鼠前列腺組織中BAX免疫組化結果，觀察切片，空白組和假手術組大鼠的前列腺腺體排列規整，上皮細胞排列緊密，腺腔規則平整，腔內基本無炎性細胞浸潤。模型組大鼠前列腺腺體向腔內呈乳頭狀凸起，腺腔顯著縮小，腺上皮細胞排列紊亂，呈復層或假復層柱狀增生，腔內可見少量炎性細胞，腔外部分平滑肌組織被破壞，排列不緊密，提示造模成功。其余各給藥組與模型組相比，前列腺壁厚均有不同程度的減輕。

免疫組化半定量結果見表4。連續給藥28天后，空白組大鼠前列腺組織中BAX的表達與假手術組相比無顯著差異(P> 0.05)。與假手術組相比，模型組大鼠前列腺組織中BAX的表達顯著降低(P< 0.01)。與模型組相比，MGFP低、中、高劑量組、非那雄胺組以及癃閉舒膠囊組均可顯著升高BAX的表達(P< 0.01)，其中MGFP高劑量組及非那雄胺組效果更好。

表4 MGFP對BPH模型大鼠前列腺組織中BAX蛋白表達的影響

圖9 各組大鼠前列腺組織中BAX蛋白表達情況(×200)Fig.9 Expression of BAX protein in prostate tissue of rats in each group (×200)注：A：空白組；B：假手術組；C：模型組；D：MGFP低劑量組；E：MGFP中劑量組；F：MGFP高劑量組；G：非那雄胺組；H：癃閉舒膠囊組。紅色箭頭表示免疫組化陽性表達區域；黑色箭頭表示前列腺組織壁厚。Note:A:Control group;B:Sham operation group;C:Model group;D:MGFP-L group;E:MGFP-M group;F:MGFP-H group;G:Finasteride group;H:Longbishu group.Red arrow indicates immunohistochemical positive expression area;Black arrow indicates the wall thickness of prostate tissue.

4 討論與結論

據報道，BPH的發病機制主要與性激素、生長因子、炎癥反應、細胞凋亡異常等有關[9]，其主要病理特征表現為前列腺上皮細胞和基質細胞的增殖。MGFP此方寒溫并用，有活血消癥、軟堅利水之效，能夠明顯改善“腎氣虧虛、瘀血阻滯”所致的BPH。現代藥理研究表明，桂枝茯苓丸的成分主要包括丹皮酚、芍藥苷、桂皮醛、茯苓素及苦杏仁苷等，其通過改善血液流變學參數可以降低血液黏稠度，一般用于治療瘀血(濁)蘊結所致的BPH[10]等疾病。另外還發現，王不留行既能延長血瘀證模型大鼠的凝血時間，又能降低大鼠全血黏度[11]；水蛭所含水蛭素具有抗血凝、抗血栓的作用[12]；而烏藥的主要成分揮發油又能上宣肺氣，下輸膀胱以緩解泌尿系統結石潴留，從而通利小便[13]。由此可見，MGFP中的化學成分可以通過一定途徑達到治療BPH的目的，體現了中藥復方多成分、多靶點、多通路的作用機制。

本研究通過韋恩圖得到交集靶點212個，再根據KOBAS分析結果中的核心通路反向匹配出MGFP治療BPH的核心靶點，結合degree值排名、文獻，得到與BPH發病機制聯系密切的核心靶點，包括AKT1、BAX、BCL2、JUN、TGFB1、TNF、IL6、VEGFA、EGFR。上述靶點主要與細胞凋亡、血管生長以及炎癥有關。據報道，AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在AKT亞型中，AKT1可抑制凋亡和促進細胞生長、存活，參與BPH的發展[14]。VEGFA是具有高度特異性的血管內皮細胞有絲分裂素，與前列腺新生血管的形成和維持密切相關，活化的AKT磷酸化eNOS以產生NO，促進VEGFA誘導的內皮細胞遷移、血管舒張、血流量增加和血管生成[15]。IL-6是一種功能廣泛的多效性細胞因子，在前列腺組織中，IL-6經自分泌途徑促進前列腺基底上皮細胞的增殖，造成機體內前列腺細胞增殖和凋亡失衡，從而誘導BPH的發生[16]。

本研究通過GO功能注釋分析發現，MGFP參與的生物學進程主要富集在血管生長相關過程、氧化應激相關過程、凋亡相關過程、凝血相關過程及免疫相關過程等，其調控BPH的分子功能主要富集在轉錄因子結合、核受體活性、蛋白激酶活性、細胞因子受體結合、腎上腺素能受體活性、RNA聚合酶II轉錄因子結合等。

本研究通過KEGG通路富集分析發現，MGFP對AGE-RAGE信號通路、PI3K-AKT信號通路、細胞凋亡、IL-17信號通路、Th17細胞分化、TNF信號通路、VEGF信號通路、MAPK信號通路、Ras信號通路、Rap1信號通路等有調控作用。研究表明，AGE-RAGE可以刺激促炎因子的產生，從而使細胞過度增殖，導致BPH進一步發展[17]。PI3K-AKT信號通路的激活會導致促凋亡蛋白磷酸化，進而阻斷其與抗凋亡分子BCL-2、BCL-XL的結合，使BPH中細胞凋亡減少[18]。IL-17信號通路、Th17細胞分化和TNF信號通路均可介導免疫炎癥反應，報道稱，感染刺激引起BPH基質細胞產生促炎因子IL-6、IL-8和TNF，從而激活浸潤性CD4+T細胞，并通過分泌IL-12、IL-23促進其在Th1、Th17效應細胞中的分化；而活化的Th1、Th17淋巴細胞則會產生促炎細胞因子，如IL-17，促進免疫炎癥反應，導致前列腺細胞增生[19]。VEGF是一種由PI3K-AKT信號通路介導的血管生成因子，可促進間質組織中的血管生成和細胞增殖，在BPH發展中也起關鍵作用[20]，再結合核心靶點的結果和圖6所示，我們推測PI3K-AKT信號通路和VEGF信號通路間有密切關聯。MAPK、Ras信號通路參與調控細胞的基本生物學活動，包括增殖、凋亡、分化和衰老，MAPK級聯反應具有Ras依賴性，其異常激活會造成機體細胞增殖/凋亡失衡[21]。另外，還發現Rap1信號通路的激活會促進細胞增殖和遷移，進而使前列腺體積增大[22]。由此推測，MGFP可能通過調節多條信號通路來影響炎癥反應、細胞凋亡和增殖，起到治療BPH的目的。

本研究通過分子對接發現，MGFP的核心成分槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、黃芩素、鞣花酸與AKT1、BAX、BCL2、JUN、TGFB1、TNF、IL6、VEGFA、EGFR的結合能均小于0，說明相互間可以自發結合，而槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、黃芩素、鞣花酸與AKT1、BAX、JUN、TNF、VEGFA的結合能均小于-20 929 J/mol，具有較強的結合能力，以BAX與β-谷甾醇的對接結果最優。研究表明，β-谷甾醇是一種植物甾醇，會干擾多種細胞信號通路，對細胞周期、細胞凋亡、增殖、血管生成等過程造成影響，臨床常用于心臟病、肺結核、宮頸癌等疾病[23]。在細胞凋亡過程中，促凋亡的BAX易位到線粒體并與線粒體外膜整合，誘導線粒體外膜通透化釋放出細胞色素c，使細胞正常死亡[24]。Sharmila等[25]建立二乙基亞硝胺誘導的大鼠腎癌模型，結果發現，β-谷甾醇治療組大鼠BAX蛋白表達顯著增加。另外，一項多中心、安慰劑對照、雙盲的研究顯示β-谷甾醇對BPH也有明顯改善作用，但其作用機制尚不明確[26]。

本研究通過建立BPH大鼠模型探討前列腺組織中BAX的表達情況，結果表明，與假手術組相比，模型組大鼠腺上皮細胞增生，腺腔顯著縮小，而其余各治療組與模型組相比，前列腺壁厚均有不同程度的減輕，提示MGFP對BPH模型大鼠有一定治療效果。免疫組化半定量結果顯示，空白組與假手術組大鼠前列腺組織中BAX的表達無顯著差異；與假手術組相比，模型組大鼠前列腺組織中BAX的表達顯著降低(P< 0.01)，表明BPH可能通過抑制前列腺組織中BAX表達，造成細胞凋亡異常。與模型組相比，MGFP低、中、高劑量組、非那雄胺組以及癃閉舒膠囊組均可顯著升高BAX的表達(P< 0.01)，可能是MGFP調節線粒體依賴性凋亡通路，使與促進細胞凋亡相關的基因BAX表達升高，抑制細胞增殖，且作用效果呈劑量依賴性。

綜上所述，MGFP可能通過槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、黃芩素、鞣花酸等核心成分調節AKT1、BAX、JUN、TNF、VEGFA等靶點以及PI3K-AKT信號通路、VEGF信號通路等進而調控機體前列腺血管生長、凋亡、氧化應激等相關生物學過程，發揮治療BPH的作用。分子對接初步預測到核心成分與關鍵靶點的最優結合模式為β-谷甾醇-BAX，并通過動物實驗探究了MGFP對BAX的作用，為MGFP的廣泛應用提供藥效學基礎。鑒于數據庫對化學成分收錄不足的局限性且中藥炮制后成分發生的變化，后續可通過指紋圖譜技術對MGFP的化學成分進行深入研究，有助于提高網絡藥理學預測結果的可靠性。