山茱萸抗過敏活性組分的篩選及其對RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒的作用

張歌珂，劉 學(xué)，楊 成，孫亞娟

江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院 合成與生物膠體教育部重點(diǎn)實驗室，無錫 214122

過敏疾病是世界衛(wèi)生組織列入21世紀(jì)重點(diǎn)研究和防治的疾病之一，在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率已達(dá)到20%～30%，故尋找有效抗過敏藥物是目前的研究熱點(diǎn)。目前抗過敏化學(xué)藥物有很多，但大多具有作用環(huán)節(jié)單一，且副作用較大的特點(diǎn)[1]，而植物提取物是具有不同結(jié)構(gòu)和來源的天然化合物的復(fù)雜混合物[2]，具有多靶點(diǎn)的抗過敏能力，對過敏反應(yīng)的不同關(guān)鍵步驟均有影響，且作用緩和，副作用小[3]。我國中藥資源豐富，為抗過敏天然物質(zhì)的研究提供了較好的基礎(chǔ)。

山茱萸(CornusofficinalisSieb.et Zucc.)是我國的一種藥食同源植物，含有環(huán)烯醚萜及其苷、三萜類、黃酮類等物質(zhì)，在中醫(yī)理論中，具有良好的補(bǔ)益功效，常用于治療虛癥、肝腎疾病和生殖系統(tǒng)疾病[4]。山茱萸具有多種生物活性，如抗過敏、抗炎、抗氧化、抗糖尿病、抗骨質(zhì)疏松、血管舒張等活性[5,6]。

Kim等[7]研究發(fā)現(xiàn)山茱萸水提物可抑制OVA誘導(dǎo)的哮喘模型中的肺過敏反應(yīng)，具有一定的抗過敏功效。Kao等[8]發(fā)現(xiàn)含有山茱萸的中藥組方可有效緩解過敏原Der-p誘導(dǎo)的過敏性哮喘癥狀，降低血清中IgE水平。Li等[9]究發(fā)現(xiàn)含有山茱萸的中藥制劑(山茱萸占比11%)對皮膚瘙癢、PCA反應(yīng)和皮膚功能障礙有明顯的抑制作用。特應(yīng)性皮炎是一種過敏性皮膚疾病，Mechesso等[10]報道了C2RPL提取物(山茱萸∶多花玫瑰∶胡枝子∶側(cè)柏∶錐栗比例為4∶1∶1∶1的組方)可改善特應(yīng)性皮炎癥狀，呈濃度依賴形式減少β-氨基己糖苷酶的釋放，表明其具有抗過敏活性。Quah等[6]發(fā)現(xiàn)山茱萸70%乙醇提取物能減少抗DNP IgE誘導(dǎo)的β-氨基己糖苷酶的釋放，表明具有抗過敏功效。

目前，對山茱萸提取物中起抗過敏作用的具體成分尚未見有報道。故本文在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步對山茱萸中抗過敏活性成分進(jìn)行探究，旨在發(fā)現(xiàn)山茱萸中具有抗過敏活性的確切成分。過敏反應(yīng)根據(jù)其機(jī)理分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型，由化學(xué)介質(zhì)如組胺、前列腺素、白三烯、炎癥因子等誘發(fā)[11]，研究表明，絕大部分Ⅰ型過敏疾病與體內(nèi)透明質(zhì)酸酶(HAase)活性相關(guān)，且HAase是直接控制肥大細(xì)胞脫顆粒(與Ⅳ型過敏反應(yīng)相關(guān))的靶酶之一[12]，因而透明質(zhì)酸酶抑制實驗和肥大細(xì)胞脫顆粒抑制實驗常用于體外抗過敏研究。

本文以透明質(zhì)酸酶抑制活性為指標(biāo)篩選山茱萸中的抗過敏組分，通過MTT法和細(xì)胞脫顆粒抑制實驗進(jìn)一步考察其抗過敏活性，得到抗過敏活性最高的組分，最后采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)對其進(jìn)行分析鑒定，以明確山茱萸中具有抗過敏活性的成分，為綜合開發(fā)利用山茱萸中抗過敏活性成分提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山茱萸(CornusofficinalisSieb.Et Zucc.)果實材料購于北京同仁堂，批號471201201；透明質(zhì)酸(HA，分子量1 000 000，批號H0443562)購于天津希恩思生化科技有限公司；透明質(zhì)酸酶來源于牛睪丸(50 KU，批號H128644)、牛血清白蛋白(純度96%，批號A116563)、芹菜素(純度≥98%，批號A106676)、鈣離子載體A23187(純度≥97%，批號C137844)、鄰苯二甲醛(OPA，純度98%，批號P108632)、4-硝基苯基-2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡萄糖苷(PNAG，純度98%，批號N107918)和組胺(純度96%，批號H111796)購于上海阿拉丁生化科技有限公司(中國)；Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM，批號SH30284.01)購于Hyclone公司；雙抗(批號15140122)和胰蛋白酶(批號25200056)購于Gibco BRL(Grand Island，NY，USA)；胎牛血清(批號FBS-PN500)購于Newzerum(Upper Riccarton，Christchurch，New Zealand)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT，純度99%，批號M2128)購于西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；二甲基亞砜(DMSO，批號20210310)、磷酸氫二鈉(批號20201012)、磷酸二氫鈉(批號20201112)、氯化鈉(批號20210310)、冰醋酸(批號20201127)、石油醚(60～90 ℃，批號20200412)、正丁醇(批號20200412)、乙酸乙酯(批號20200812)購于國藥集團(tuán)，試劑均為分析純。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(德國IKA公司)；CYTATION 5多功能微孔板酶標(biāo)儀(美國Bio Tek公司)；快速制備色譜儀(Isolera One瑞典Biotage公司)；QP2010Ultra型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 山茱萸不同極性部位的制備

將山茱萸果實烘干，粉碎后準(zhǔn)確稱取山茱萸粉末100 g，按1∶15(g/mL)的比例加入75%乙醇溶液，40 ℃超聲處理40 min，抽濾，濾渣繼續(xù)重復(fù)提取3次，合并濾液，濾液用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后，旋蒸至無醇味，加入去離子水分散均勻，依次用石油醚(60～90 ℃)、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，靜置過夜，萃取液分別減壓旋蒸至干，得到石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物，分別命名為COPE、COEE、CONE和COWE，4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 COPE分離純化

采用快速制備色譜對COPE進(jìn)一步分離純化，將COPE以干法上樣于硅膠柱頂端，首先用石油醚洗脫，再以石油醚和乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫(石油醚/乙酸乙酯100∶0→0∶100)，最后用乙醇洗脫。對洗脫流分進(jìn)行薄層色譜分析(TLC)，根據(jù)TLC分析結(jié)果合并流分，得到18個組分，依次命名為COPE-1～COPE-18。將各組分在30 ℃下減壓旋蒸至干，稱重后用石油醚定容，-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 透明質(zhì)酸酶(HAase)抑制實驗

參照文獻(xiàn)[13]方法并適當(dāng)改善，測定樣品對HAase活性的抑制作用。簡述如下：分別取100 μL HAase(20 mmol/L溶于磷酸緩沖液pH 7)與5 μL樣品加入離心管中，混勻后37 ℃反應(yīng)10 min；加入100 μL透明質(zhì)酸溶液(0.05%，溶于300 mmol/L磷酸鈉緩沖液pH 5.35)，37 ℃反應(yīng)45 min；加入1 mL酸性白蛋白溶液(0.1%牛血清白蛋白溶于醋酸緩沖液pH 3.75)使未分解的透明質(zhì)酸沉淀，室溫下反應(yīng)10 min后立即用酶標(biāo)儀在600 nm處測定吸光值。對照組將HAase替換為100 μL磷酸緩沖液。空白組將樣品替換為5 μL水。陽性對照品為芹菜素，陰性對照為樣品溶劑，每組樣品重復(fù)3次。IC50值為抑制率為50%時的樣品濃度。HAase抑制率計算公式如下：

透明質(zhì)酸酶抑制率=

式中：As為不含HAase的樣品的吸光值；Bs為含HAase的樣品的吸光值；An為不含HAase的樣品溶劑的吸光值；Bn為含HAase的樣品溶劑的吸光值；Aw為不含HAase的空白組的吸光值；Bw為含HAase的空白組的吸光值。

1.2.4 MTT法測定活性組分的細(xì)胞毒性

RBL-2H3細(xì)胞在含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)液使用含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM。在細(xì)胞長至80%～90%時，在96孔板以1.5×105個/mL的密度接種細(xì)胞。細(xì)胞活力通過MTT實驗進(jìn)行，具體步驟如下所述[14]，細(xì)胞在96孔板中孵育24 h后，加入樣品100 μL再次孵育24 h，棄培養(yǎng)液加入100 μL 0.05% MTT溶液，避光培養(yǎng)4 h，小心吸去溶液，加入100 μL DMSO，酶標(biāo)儀振蕩后測定490 nm處的吸光值，按下述公式計算細(xì)胞存活率：

式中：As為樣品組吸光值；Ac為對照組吸光值；Ab為空白組吸光值。

1.2.5 細(xì)胞脫顆粒抑制實驗

采用鈣離子載體A23187刺激細(xì)胞脫顆粒。RBL-2H3細(xì)胞與樣品于37 ℃孵育30 min后，加入鈣離子載體(400 ng/mL，溶于臺式液)37 ℃孵育30 min。收集上清液，-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5.1β-氨基己糖苷酶釋放檢測

β-氨基己糖苷酶釋放依據(jù)文獻(xiàn)[3]方法測定。取30 μL上清液至96孔板中，加入50 μL PNAG(溶于0.1 mol/L檸檬酸緩沖液pH 4.5，1.3 mg/mL)混勻，37 ℃反應(yīng)60 min。然后加入80 μL 0.5 mol/L NaOH。酶標(biāo)儀測定反應(yīng)液在405 nm處的吸光度。

1.2.5.2 組胺釋放檢測

組胺釋放的測定參考文獻(xiàn)[15]并適當(dāng)改善。通過將組胺轉(zhuǎn)化為熒光組胺-OPA-產(chǎn)物間接測定組胺含量。250 μL上清液中加入50 μL 1 mol/L NaOH和12.5 μL 1% OPA，將組胺轉(zhuǎn)化為熒光組胺OPA產(chǎn)物。室溫反應(yīng)4 min后，加入25 μL 3 mol/L HCl終止反應(yīng)。通過酶標(biāo)儀測定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長為360 nm，發(fā)射波長為450 nm。組胺釋放率以樣品組吸光值與最大釋放組吸光值的比值表示。

1.2.6 GC-MS分析

GC-MS分析條件參考文獻(xiàn)[16,17]，并適當(dāng)調(diào)整。

氣相色譜條件：色譜柱(RTX-5MS 30 m × 0.25 mm，0.25 μm)；載氣為氦氣，進(jìn)樣量1 μL；流速為1.1 mL/min；分流比30∶1；柱箱溫度設(shè)置為100 °C，保持1 min，然后升至220 °C，再以30 °C/min的速度升至300 °C，保持10 min。

質(zhì)譜條件：離子源EI 200 °C；電子能量70 eV；倍增電壓1 000 V；質(zhì)量掃描范圍：34～850 amu；采集方式：掃描。采用峰面積歸一化法確定組分的相對含量；以標(biāo)準(zhǔn)譜庫NIST11作為質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果與分析

2.1 山茱萸不同極性部位的透明質(zhì)酸酶抑制作用

透明質(zhì)酸酶抑制實驗結(jié)果顯示COPE的透明質(zhì)酸酶抑制活性最高(IC50值為3.11 mg/mL)，其次是COWE(IC50值為13.31 mg/mL)和COEE(IC50值為18.16 mg/mL)，CONE的抑制活性較低，IC50值為65.47 mg/mL。山茱萸中極性較小的物質(zhì)的抗過敏活性更高。因此，對COPE進(jìn)一步分離純化。

2.2 COPE分離純化及透明質(zhì)酸酶抑制作用

經(jīng)硅膠柱色譜分離純化共獲得55個流分，分別標(biāo)記為石油醚洗脫流分、1～53和乙醇洗脫流分，1～53號流分的TLC分析結(jié)果如圖1所示，綜合紫外光燈(365 nm)下檢識的結(jié)果和10%硫酸乙醇溶液顯色檢識的結(jié)果，將具有相同Rf值且顏色相同的點(diǎn)進(jìn)行合并，分別將合并的流分進(jìn)行減壓濃縮，最終得到18個組分，依次命名為COPE-1～COPE-18。其中，COPE-1的產(chǎn)率最高，為21.2%，其次是COPE-18(19.2%)和COPE-4(13.8%)。

圖1 COPE流分薄層色譜圖Fig.1 TLC chromatogram of fractions of COPE注：A：紫外光燈顯色(365 nm)；B：10%硫酸乙醇溶液顯色。Note:A:Coloration results under UV lamp (365 nm);B:Coloration results of 10% sulfuric acid ethanol solution.

本實驗采用同為天然化合物的芹菜素作為陽性對照品，其是一種已知的透明質(zhì)酸酶抑制劑[18,19]。COPE-1～COPE-18的透明質(zhì)酸酶抑制活性如圖2所示，其中有12個組分與溶劑對照存在顯著差異，COPE-8、COPE-9、COPE-10在2.5 mg/mL的濃度下對透明質(zhì)酸酶抑制作用相當(dāng)，COPE-7抑制作用略低，但它們都優(yōu)于同濃度的陽性對照品芹菜素。COPE-7、COPE-8、COPE-9、COPE-10對透明質(zhì)酸酶的IC50值分別為1.12、1.07、0.87、1.04 mg/mL，均低于芹菜素的IC50值(2.02 mg/mL)，表明它們均具有優(yōu)異的透明質(zhì)酸酶抑制活性，具有較好的抗過敏潛力。繼續(xù)通過細(xì)胞脫顆粒抑制實驗考察4個組分對RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒釋放組胺和β-氨基己糖苷酶的抑制作用作進(jìn)一步篩選。

圖2 石油醚部位組分的透明質(zhì)酸酶抑制活性Fig.2 Anti-hyaluronidase activity of 18 fractions of COPE注：COPE-1～COPE-18濃度為2.5 mg/mL；Api為芹菜素，濃度為2.5 mg/mL；Solvent control為樣品溶劑(20% DMSO)對照；與芹菜素相比，**P < 0.01。Note:The concentrations of COPE-1-COPE-18 are 2.5 mg/mL;Api is apigenin (2.5 mg/mL);Solvent control is the solvent of sample (20% DMSO);Compared with Api,**P < 0.01.

2.3 山茱萸抗過敏組分的脫顆粒抑制作用

2.3.1 山茱萸抗過敏組分的細(xì)胞毒性

采用MTT法檢測不同組分對RBL-2H3細(xì)胞活力的影響，結(jié)果如圖3～6所示，COPE-7在所有測試濃度下，對細(xì)胞均無毒性(細(xì)胞活力≥90%)；COPE-8在不高于20 μg/mL的濃度下沒有明顯的細(xì)胞毒性；COPE-9和COPE-10在不高于1.25 μg/mL的濃度下，沒有明顯的細(xì)胞毒性。

2.3.2 山茱萸抗過敏組分對組胺和β-氨基己糖苷酶釋放的抑制作用

RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒已廣泛應(yīng)用于過敏和免疫學(xué)研究，特別是在篩選分離的化合物和天然提取物的抗過敏特性方面得到了廣泛的應(yīng)用[3]。刺激物鈣離子載體A23187在不高于400 ng/mL的濃度時無細(xì)胞毒性，因此實驗使用400 ng/mL的A23187對RBL-2H3細(xì)胞進(jìn)行刺激。脫顆粒抑制實驗結(jié)果如圖7～10所示，4個組分均呈濃度依賴形式抑制A23187刺激的細(xì)胞脫顆粒水平。COPE-7、COPE-8、COPE-9、COPE-10在無細(xì)胞毒性的最高濃度下分別將組胺水平降至(47.6±1.9)%、(54.3±0.9)%、(67.0±2.3)%和(73.3±2.7)%；將β-氨基己糖苷酶水平降至(55.3%±1.2)%、(60.8%±3.3)%、(72.6%±3.4)%和(82.0±1.6)%。由結(jié)果看出，與COPE-7相比，同濃度條件下COPE-8的抑制作用最好，分別將組胺水平和β-氨基己糖苷酶水平降低了46%和39%。因此，推測COPE-8為山茱萸中最主要的抗過敏活性物質(zhì)。

圖3 COPE-7的細(xì)胞毒性Fig.3 Cytotoxicity of COPE-7

圖4 COPE-8的細(xì)胞毒性Fig.4 Cytotoxicity of COPE-8注：與對照組(樣品濃度為0 μg/mL)相比，**P < 0.01，下同。Note:Compared with control (the concentration of sample is 0 μg/mL),**P < 0.01,the same below.

圖5 COPE-9的細(xì)胞毒性Fig.5 Cytotoxicity of COPE-9

圖6 COPE-10的細(xì)胞毒性Fig.6 Cytotoxicity of COPE-10

圖7 COPE-7對組胺和β-氨基己糖苷酶釋放的抑制作用Fig.7 The effect of COPE-7 on β-hexosaminidase and histamine release注：Api為芹菜素，濃度為20 μg/mL；A23187為刺激物鈣離子載體A23187，濃度為400 ng/mL；“+”表示添加，“-”表示不添加；與“樣品(-)，A23187(+)”相比，**P < 0.01；*P < 0.05，下同。Note:Api is apigenin (20 μg/mL);A23187 is calcium ionophore A23187 (400 ng/mL);‘ + ’ means to add;‘ - ’ means not to add;Compared with ‘sample (-),A23187 (+)’,**P < 0.01;*P < 0.05. The same below.

圖8 COPE-8對組胺和β-氨基己糖苷酶釋放的抑制作用Fig.8 The effect of COPE-8 on β-hexosaminidase and histamine release

圖9 COPE-9對組胺和β-氨基己糖苷酶釋放的抑制作用Fig.9 The effect of COPE-9 on β-hexosaminidase and histamine release

圖10 COPE-10對組胺和β-氨基己糖苷酶釋放的抑制作用Fig.10 The effect of COPE-10 on β-hexosaminidase and histamine release

2.4 COPE-8的化學(xué)成分分析

4個活性組分中，COPE-9和COPE-10的細(xì)胞毒性較高，與COPE-7相比，COPE-8對RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒抑制作用最好，且得率相對較高(6.5%)，成分組成相對較少，故對COPE-8進(jìn)行GC-MS分析，得到的COPE-8總離子流色譜圖見圖11，利用峰面積歸一法對各成分的相對含量進(jìn)行計算，與標(biāo)準(zhǔn)譜庫NIST11的質(zhì)譜峰進(jìn)行比對共鑒定出12個化合物，由表1可見，已鑒定成分占總COPE-8的96.01%，其主要成分為α-香樹脂醇(19.12%)、6a，14a-甲醇烯，全氫-1，2，4a，6b，9，9，12a-七甲基-10-羥基(16.71%)、n-棕櫚酸(16.38%)、δ-14-千層塔烯(13.1%)和β-香樹脂醇(11.94%)。α-香樹脂醇和β-香樹脂醇都是五環(huán)三萜類化合物，結(jié)構(gòu)非常相似，已有研究表明兩種三萜類化合物的混合物顯示出免疫刺激、抗炎、抗焦慮和抗抑郁活性[20]，其中β-香樹脂醇具有較好的透明質(zhì)酸酶抑制活性，其IC50值為33.98 μg/mL[21]。據(jù)Oliveira等報道，α-香樹脂醇和β-香樹脂醇可有效抑制小鼠的抓撓行為，且顯著抑制化合物48/80誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒，抑制率高達(dá)86%[22]，表明α-香樹脂醇和β-香樹脂醇具有一定的抗過敏活性。香紫蘇醇可顯著減輕特應(yīng)性皮炎癥狀，減少肥大細(xì)數(shù)量[23]，且能通過減少炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)和提高抗氧化酶的活性表現(xiàn)出對LPS刺激的巨噬細(xì)胞的抗炎活性[24]。

圖11 COPE-8的總離子流圖Fig.11 Total ion chromatogram of the COPE-8

表1 COPE-8化學(xué)成分

續(xù)表1(Continued Tab.1)

3 結(jié)論與討論

本文通過比較山茱萸不同極性部位的透明質(zhì)酸酶抑制活性，發(fā)現(xiàn)山茱萸石油醚部位活性顯著高于其他部位，表明山茱萸中極性較小的物質(zhì)抗過敏活性更高。據(jù)Li等[9]報道，含有山茱萸的中藥組方提取物在3 mg/mL時對透明質(zhì)酸酶的抑制率為70%，具有較好的抗過敏作用，而本文通過硅膠柱色譜法分離得到的組分COPE-8僅在2.5 mg/mL時就表現(xiàn)出超過70%的透明質(zhì)酸酶抑制率，表明其具有更高的抗過敏活性。

肥大細(xì)胞活化后分泌和釋放介質(zhì)及炎癥因子等引發(fā)過敏反應(yīng)，此過程稱為肥大細(xì)胞脫顆粒，是機(jī)體發(fā)生過敏的重要環(huán)節(jié)[25]。在釋放的促炎介質(zhì)中，組胺是最具特征和最有效的血管活性介質(zhì)，并被認(rèn)為是脫顆粒的標(biāo)志[26]。故本實驗通過評價4個活性組分對組胺和β-氨基己糖苷酶釋放的影響評價其抗過敏活性，進(jìn)一步篩選得到活性最好的COPE-8組分，其在20 μg/mL時將組胺和β-氨基己糖苷酶釋放水平分別降低46%和39%，而以山茱萸為主的組方C2RLP提取物在30 μg/mL時僅將β-氨基己糖苷酶釋放水平降低24%[10]，此外山茱萸70%乙醇提取物在30 μg/mL時也僅將β-氨基己糖苷酶釋放水平降低18%[6]，進(jìn)一步說明組分COPE-8在抗過敏活性方面的優(yōu)勢。

本研究首次以透明質(zhì)酸酶抑制活性為導(dǎo)向探索山茱萸中抗過敏活性成分。通過對山茱萸提取物的系統(tǒng)分離純化，得到具有顯著抑制透明質(zhì)酸酶活性和細(xì)胞脫顆粒作用的COPE-8組分，其能顯著降低鈣離子載體A23187誘導(dǎo)的組胺和β-氨基己糖苷酶的釋放，且優(yōu)于目前已報道的山茱萸粗提物或組方提取物，表明其具有較強(qiáng)的抗過敏活性。通過GC-MS分析明確了COPE-8中的抗過敏活性物質(zhì)主要為萜類化合物，包括α-香樹脂醇、β-香樹脂醇和香紫蘇醇，且它們還具有抗炎、抗氧化等作用[20,24,27]，表明其具有廣泛的生物活性。

綜上所述，山茱萸中具有抗過敏活性的成分為α-香樹脂醇、β-香樹脂醇和香紫蘇醇，其具有較強(qiáng)的抗過敏活性，且兼具抗炎和抗氧化等生物活性，具有廣泛的應(yīng)用前景。