鐵皮石斛軟腐病菌終極腐霉生物學特性及其抑菌植物篩選

譚智勇，周震宇，楊文明，李亞娟，盧志宏

1湘南學院，郴州 423000；2銅仁學院，銅仁 554300；3貴州梵天農業科技有限責任公司，銅仁 554400；4湖南梵宇景觀規劃設計有限責任公司，郴州423000；5銅仁市農業科教信息站，銅仁 554300

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)為蘭科石斛屬多年生附生草本植物，是名貴中藥材“石斛”的來源之一，具有增強機體免疫力、益胃生津，滋陰清熱等功效[1]，也可作為保健品的原材料，具有較大的市場需求和較高的經濟價值，為了滿足不斷擴大的市場需求，其人工種植面積也不斷擴大，主要分布在我國的云南、貴州、浙江、福建、廣東以及四川等地區[2]。

隨著鐵皮石斛在各地產業化栽培的大力發展，其種植過程中病害的發生也越來越嚴重，其中鐵皮石斛軟腐病是一種毀滅性的病害，田間一旦發生，常造成嚴重的經濟損失[3]。由終極腐霉引起的鐵皮石斛軟腐病病株莖部呈水浸狀，逐漸發展到葉片，水浸狀黑褐色壞死，莖倒伏，濕腐狀，比較透明，表面有白色菌絲出現[4]，目前生產上對于該病害的防治仍以化學防治為主，存在農藥殘留、容易產生抗藥性、污染環境等問題[5,6]。關于鐵皮石斛軟腐病生物防治的研究論文較少，且多集中于生防菌和植物源農藥的室內篩選，未開展大田試驗，其田間效果有待進一步驗證。Li等[7]研究發現了石斛屬植物內兩株內生真菌有拮抗終極腐霉的活性，并通過盆栽試驗證明石斛屬植物內生真菌具有良好的生物防治鐵皮石斛軟腐病效果。He等[8]研究表明：0.3%四霉素AS、1%申嗪霉素SC、0.3%丁子香酚SL、1%蛇床子素EW均對終極腐霉菌絲生長的抑制效果較好，其EC50值分別為0.13、0.21、0.29、5.04 mg/L。

植物病害病原菌受易受光照、溫度、pH值和營養物質等因子的影響[9,10]，同時初篩出對植物病害真菌有一定抑制作用的丁香(EugeniacaryophyllataThunb.)等34種中藥材[1,11-17]，開展終極腐霉生物學特性及其抑菌植物的篩選研究，旨在為研究和開發用于防治鐵皮石斛軟腐病的高效、低毒和安全的植物源殺菌劑提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試病原真菌

供試的鐵皮石斛軟腐病菌終極腐霉(Pythiumultimum)由北京北納創聯生物技術研究院提供。

1.1.2 植物材料

34種中藥材購于銅仁市大健康產業園(具體名單如表1所示)，粉碎機粉碎后過20目篩，得到的粉末于置于陰涼干燥處密封保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 生物學特性測定

1.2.1.1 生長速度測定

用直徑5 mm的打孔器在PDA平板上打取菌落邊緣新鮮菌絲塊，接至PDA培養基中，置于25 ℃培養箱恒溫培養，每隔12 h用十字交叉法測量菌落直徑，直至菌落長滿培養皿，每個處理3個重復。

1.2.1.2 溫度對菌絲生長的影響

用直徑5 mm的打孔器在PDA平板上打取菌落邊緣新鮮菌絲塊，接至PDA培養基中，分別置于溫度設置為5、10、15、20、25、30和35 ℃的培養箱中培養，每個處理重復3次，待第一組菌絲長滿培養基后用十字交叉法測量所有培養皿菌落直徑。

1.2.1.3 pH對菌絲生長的影響

用0.1 %的NaOH和0.1 %HCI配制pH為2、3、4、5、6、7、8和9的PDA培養基，用直徑5 mm的打孔器在PDA平板上打取菌落邊緣新鮮菌絲塊，接至于上述不同pH的PDA平板上，設3組重復，置于25 ℃培養箱恒溫培養48 h，用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.1.4 不同碳、氮源對菌絲生長的影響

以沙氏培養基為基礎培養基，分別等量替換其中的碳源和氮源。其中供試碳源分別為葡萄糖、蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，甘露醇，肌醇，可溶性淀粉來配制成不同碳源的培養基，設置對照組不加碳源。供試氮源分別為硝酸鈉，硫酸銨，丙氨酸，甘氨酸，蛋白胨，酵母浸膏，配制成不同氮源的培養基，以不加氮源的培養基為對照。用滅菌打孔器取菌落邊緣新鮮菌絲塊，分別接種于含不同碳、氮源的培養基上，重復3組，置于25 ℃培養箱恒溫培養96 h，用十字交叉法測量所有培養皿菌落直徑。

1.2.1.5 光照對菌絲生長的影響

將病原菌轉接至PDA平板中央，設全光、全黑暗和光暗交替3個處理，重復3組，置于25 ℃培養箱恒溫培養，間隔12 h用十字交叉法測量菌落直徑直至菌絲長滿培養基。

1.2.2 對鐵皮石斛軟腐病菌具有抑制作用的植物提取物的篩選

1.2.2.1 植物提取液的制備

采用振蕩提取法。稱取20 g植物粉末，按料液比1∶20(即20 g藥用植物，加入400 g的水)30 ℃搖床振蕩培養24 h，抽濾，收集濾液，75 ℃旋轉蒸發至近干，用無菌水定容至50 mL，即得到藥用植物的水提取物母液，濃度為0.4 g干樣/mL(即每1 mL提取物中含0.4 g植物干物質)，作為母液，保存于4 ℃備用。

1.2.2.2 含提取物PDA培養基的制備

在無菌條件下，將藥用植物水提取物與已滅菌并冷卻到50 ℃左右的PDA培養基均勻混合，制成藥用植物水提取物濃度為40 mg干樣/mL的含藥培養基。以此方法，得到不同種類藥用植物水提取物的含藥培養基。

1.2.2.3 植物提取物對鐵皮石斛軟腐病菌抑制活性測定

采用菌絲生長速率法測定藥用植物水提取物對供試菌菌落生長的抑制作用，重復3組，置于25 ℃培養箱恒溫培養，待對照(CK)長滿培養皿后，用十字交叉法測量菌落直徑，根據公式(1)計算抑菌率。

(1)

2 結果與分析

2.1 生長速度

由圖1可知，終極腐霉在PDA培養基上菌絲生長速度較快，48 h菌絲長滿培養皿，菌絲在36 h以內平均生長速度為0.22 cm/h。

圖1 菌絲的生長速度Fig.1 Growth rate of mycelium注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0. 05)；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0. 01)，下同。Note:Different lowercase letters in graph indicate significant differences(P<0.05);Different uppercase letters in graph indicate extremely significant differences(P<0.01),the same below.

2.2 溫度對菌絲生長的影響

由圖2可知，終極腐霉在5～35 ℃之間均可以生長，在30 ℃時菌絲生長速度最快，在36 h時即可長滿培養皿。在5～30 ℃之間，菌絲生長速度隨溫度的升高而加快，30 ℃之后菌絲生長速度隨溫度的升高而降低。這一研究結果與引起的鐵皮石斛軟腐病在夏季高溫時易發生的報道相符[11]，說明在夏季高溫下更適宜病原菌的生長。

圖2 溫度對菌絲生長的影響Fig.2 Effect of temperature on mycelium growth

2.3 pH對菌絲生長的影響

由圖3可知，終極腐霉菌絲在pH為4及以下時48 h以內未長出菌絲，pH在5～9之間時有菌絲生長，在pH為5時48 h菌落直徑僅為2.24 cm，隨著pH增大，菌絲生長速度加快，當pH為6、7時菌落48 h長滿培養皿；當pH高于8以上時，菌絲生長速度減慢。終極腐霉在pH在6～7之間時菌絲生長速度最快。因此，在滿足鐵皮石斛正常生長的情況下，可以通過調節其栽培環境pH值來達到防控軟腐病的目的。

圖3 pH對菌絲生長的影響Fig.3 Effect of pH on mycelium growth

2.4 不同碳、氮源對菌絲生長的影響

由圖4可知，終極腐霉菌絲在不同的碳源培養基上均能生長，96 h菌絲均能長滿培養皿，但菌絲生長情況差異較大。病原菌在葡萄糖、可溶性淀粉為碳源的培養基上生菌絲生長相對旺盛、濃密。在乳糖、甘露醇和肌醇上，菌絲呈半透明狀、稀薄、可見度低，菌絲長勢相對較差。

由圖5可知，終極腐霉菌絲在不同的氮源培養基上均能生長，酵母浸膏、蛋白胨96 h菌絲均能長滿培養皿，在酵母浸膏上生長最好，菌絲生長旺盛、濃密。在蛋白胨上生長次之，菌絲相對旺盛、濃密。病原菌在硫酸銨、丙氨酸和甘氨酸上的菌落直徑較小，菌絲稀疏、較短。因此，在滿足鐵皮石斛正常生長的情況下，可以通過選擇適合氮源肥料來達到防控軟腐病的目的。

圖5 不同氮源對菌絲生長的影響Fig.5 Effects of different nitrogen sources on mycelium growth注：圖中A～F分別表示CK、硫酸銨、丙氨酸、甘氨酸、蛋白胨、酵母浸膏。Note:A-F represent CK,ammonium sulfate,alanine,glycine,peptone and yeast extract,respectively.

表1 光照對菌絲生長的影響

2.5 光照對菌絲生長的影響

由表1可知，全光、全黑暗和光暗交替處理下終極腐霉菌絲在48 h均能長滿培養皿。在12 h時，各處理間菌絲直徑無顯著差異。在36 h時，全光與全黑暗處理間無顯著差異，但與光暗交替處理差異性顯著。

2.6 對鐵皮石斛軟腐病菌具有抑制作用的植物提取物的篩選

采用生長速率法測定了34種藥用植物水提取物對終極腐霉的影響。由表2可知：不同藥用植物提取物對供試菌菌絲生長存在差異。當水提物濃度為40 mg干樣/mL時，丁香水提物的抑制效果最好，抑制率為100%。抑菌率在60%以上的藥物有薄荷(96.48%)、五加皮(67.78%)、黃連(66.10%)和銀杏葉(63.41%)的水提物。蘆薈、蒲公英、木香、蒼耳、穿心蓮、麻黃、大黃、甘草、獨活、苦參、陳皮、牛蒡、決明、黃精、黃柏、紫蘇葉、馬鞭草和虎杖水提物的抑菌率在9.65%～56.15%。紫蘇子、半夏、側柏、百部、紫草、蒼術、天麻、當歸、魚腥草、細辛和天南星水提物對終極腐霉菌絲生長均無抑制作用。

3 討論與結論

本文研究結果表明，終極腐霉在5～35 ℃之間均可以生長，在30 ℃時菌絲生長速度最快，在該溫度環境下有利于病害的發生。病菌在pH5～9之間均可以生長，最適宜的pH為6～7。營養元素是病原菌生長不可缺少的條件，碳源和氮源是病菌生長中最基本、最重要的兩大要素[12]。終極腐霉可利用多種碳、氮源，其中葡萄糖和可溶性淀粉為最適碳源，乳糖、甘露醇和肌醇作為碳源時不利于菌絲生長。酵母浸膏為最適氮源，硫酸銨、丙氨酸和甘氨酸作為氮源時不利于菌絲生長。培養48 h時光照條件對終極腐霉菌絲生長影響不顯著。

表2 藥用植物水提取物對菌絲生長的抑制效果

續表2(Continued Tab.2)

本文研究了34種中藥材水提物(濃度為40 mg干樣/mL)對終極腐霉抑制作用，結果表明，丁香等23種中藥材水提物對終極腐霉有抑制作用，抑菌率在9.65%～100%。Huang等[13]研究表明鄂西北野生植物蒲公英無水乙醇提取物濃度為40 mg/mL時對終極腐霉的抑菌率為53.47%，高于本文中蒲公英水提取物同濃度的抑菌率(51.09%)，但數值相差不大，可能是由于藥物品種差異、不同提取劑選擇或提取物濃度表述方式不同導致的。Júlia等[14]研究表明蘆薈粗提物對同屬腐霉屬的瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)有抑制作用。紫蘇不同部位紫蘇子、紫蘇葉的水提物在本研究中表現出不同的抑菌效果，在今后的研究中可關注兩者水提物質的差異性，以期找到其抑菌活性物質，為植物源農藥開發提供理論依據。

本文中抑菌效果表現優異的兩種中藥材分別是薄荷(96.48%)和丁香(100%)。薄荷是一種在我國廣泛分布的多年生草本植物，被廣泛用于日化、食品、藥品等領域[15-17]。前人針對薄荷的抑菌實驗多集中在金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)等人類病原菌的研究上[18-20]，Liu等[21]研究表明一定濃度薄荷精油對幾種引起果實采后病害的病原真菌的有較強的抑制作用，本文首次報道了薄荷水提物對鐵皮石斛軟腐病菌終極腐霉的抑制作用，其水提物抑菌效果較強，且薄荷種植廣泛，相對其他中藥材成本低廉，具有良好的防治鐵皮石斛軟腐病的應用潛力。

丁香是一種常見的中草藥和香料，已有的研究表明丁香對多種植物病原菌生長有一定的抑制效果[16,22]，目前我國以丁香為主要原料生產的丁子香酚植物源農藥已完成登記工作，并形成了產品，登記作物為番茄、馬鈴薯、葡萄、觀賞牡丹等。He等[8]研究表明0.3%丁子香酚SL對終極腐霉菌絲生長的抑制效果較好，這與本人研究結果相同，同時丁子香酚可能是丁香抑制終極腐霉的主要抑菌活性成分，其結果可為鐵皮石斛軟腐病終極腐霉田間防治提供參考，對于該植物源農藥拓展使用范圍有一定指導意義。