旱芹菜根乙酸乙酯部位化學成分及其細胞毒活性

楊曉軍，王 超，賈云鵬，郝書苑，王雪梅，岳昌武

1延安大學化學與化工學院；2延安大學醫學院，延安 716000

芹菜ApiumgraveolensL.是傘形科一年生或兩年生草本植物。有西芹、旱芹等多種栽培品種，藥用以旱芹為多[1]。目前國內外對旱芹化學成分的研究主要集中在地上部分的莖和葉，并從中分離鑒定出包括黃酮、萜類和香豆素等多種活性成分[2]，而對于其地下部分，特別是根部的研究卻很少。雖然民間有很多關于旱芹菜根治病的小偏方，但缺乏科學的理論依據。課題組期望通過對旱芹菜根化學成分系統深入的研究來揭示其藥效物質基礎。前期研究已從旱芹菜根中分離鑒定出3個化合物[3]，本文繼前期研究，繼續對其乙酸乙酯部位化學成分進行了分離純化，并對分離得到的單體化合物進行細胞毒活性測試，為旱芹菜根的開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

X-4型顯微熔點儀(上海科學儀器有限公司)；IR Prestige-21紅外光譜儀(日本島津公司)；AV-500 型核磁共振儀(瑞士Bruker公司)，TMS為內標；MAT-711型質譜儀(美國Thermo公司)；Sephadex LH-20(Pharmacia產品)；柱層析硅膠( 300～400目，青島海洋化工廠)；硅膠GF254薄層板(50 mm×100 mm，0.20～0.25 mm，青島海洋化工廠)；四甲基偶氮唑鹽溶液(MTT)試劑(Sigma公司)；陽性對照品紫杉醇(江蘇紅豆杉藥業有限公司，國藥準字H20093763，生產批號20140628)；人肝癌細胞株BEL-7402(上海美軒生物科技有限公司)、人肺癌細胞株A549(上海繼和生物科技有限公司)，人胃癌細胞株SGC-7901(上海研生生化試劑有限公司)；旱芹根于2019年10月采集自陜西省蒲城縣，經延安大學生命科學院白重炎研究員鑒定為傘形科芹屬ApiumgraveolensL.的根，標本存放于延安大學天然產物化學實驗室，標本編號為YD20191005。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取和分離

稱取旱芹根15.0 kg(干重)，用粉碎機粉碎成粉末，將此粉末裝入滲漉筒中，然后每次用4倍量的工業酒精滲漉提取，共4次(12 h/次)。提取液減壓濃縮得浸膏1.87 kg。將此浸膏在超聲波輔助下用水溶解，抽濾得濾液和水不溶物。濾液依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，每種萃取劑的用量為3倍濾液體積，并分3次萃取；各萃取液經減壓濃縮后分別得石油醚部位浸膏236 g、乙酸乙酯部位浸膏309 g和正丁醇部位浸膏552 g；將乙酸乙酯部位用硅膠柱層析分離，依次以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫(100∶0→1∶1)，洗脫餾分在薄層層析(TLC)檢測下獲得6個主成分段(E1～6)。各主成分段進一步進行純化，第E1段硅膠柱層析(洗脫劑為二氯甲烷∶乙酸乙酯=50∶1)分得化合物1(54 mg)和化合物2(29 mg)；第E2段硅膠柱層析(洗脫劑為二氯甲烷∶乙酸乙酯=30∶1)分得化合物3(15 mg)；第E3段硅膠柱層析(洗脫劑為二氯甲烷∶乙酸乙酯=20∶1)分得化合物4(18 mg)和化合物5(9 mg)；第E4段硅膠柱層析(洗脫劑為二氯甲烷∶乙酸乙酯=10∶1)分得化合物6(27 mg)和化合物7(11 mg)；第E5段硅膠柱層析(洗脫劑為二氯甲烷∶乙酸乙酯=2∶1)，將主成分合并后進一步用Sephadex LH-20凝膠柱(丙酮為洗脫劑)純化得化合物8(21 mg)；第E6段硅膠柱層析(洗脫劑為二氯甲烷∶乙酸乙酯=1∶1)，將主成分合并后進一步用Sephadex LH-20凝膠柱(甲醇為洗脫劑)純化得化合物9(8 mg)。

1.2.2 細胞毒活性[3]

采用MTT法測試化合物1～9對肝癌細胞株BEL-7402、人胃癌細胞SGC-7901和人肺癌細胞A549的體外細胞毒活性。化合物分別用DMSO溶解后配成10 mmol/L儲備液，測前稀釋到適合的濃度。將3種人體腫瘤細胞制成單細胞懸浮液，接種于96孔板上，并設空白組、陽性對照組(紫杉醇)以及實驗組，每組設3個平行孔，實驗組為100、50、25、12.5、6.25 μmol/L的含藥樣品溶液，在96孔板中直接加入各個樣品溶液10 μL，連續培養48 h后。再加入10 μL配制好的MTT溶液(5 mg/mL)，在CO2恒溫培養箱中恒溫培養，孵育后使用酶標儀測量其在波長為490 nm下的吸光度A值，按以下公式計算細胞生長抑制率。

細胞生長抑制率 =

[ (A對照-A給藥)/A對照]×100%

以樣品濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標，利用Origin 7.0軟件繪制出濃度-抑制率曲線圖。樣品活性結果以IC50(半數抑制濃度)表示，當抑制率為50%時的樣品濃度也就是細胞毒活性的IC50值。

2 實驗結果

2.1 結構鑒定

化合物1白色粉末，mp. 57.1～59.3 ℃，ESI-MS：m/z255.3 [M-H]-；分子式為C16H32O2；1H NMR(500 MHz，CDC13)δ：2.41(2H，t，J= 7.2 Hz，H-2)，1.59(2H，m，H-3)，1.38～1.21(24H，m，H-4～15)，1.03(3H，t，J= 6.9 Hz，H-16)；13C NMR(125 MHz，CDC13)δ：174.6(C-1)，34.2(C-2)，31.9(C-14)，28.8～29.4(C4～C13)，24.8(C-3)，22.7(C-15)，14.1(C-16)。以上數據和文獻[4, 5]報道一致，故確定該化合物為軟脂酸。

化合物2淡黃色黏稠液體；ESI-MS：m/z133.3 [M+H]+；分子式為C9H8O；1H NMR(500 MHz，CDC13)δ：9.77(1H，d，J= 7. 2 Hz，H-1)，7.52(1H，d，J= 15.6 Hz，H-3)，7.33(2H，d，J= 8.6 Hz，H-2′，6′)，7.26(2H，dd，J= 8.6，7.8 Hz，H-3′，H-5′)，7.19(1H，d，J= 7.8 Hz，H-4′)，6.74(1H，dd，J= 15.6，7.2 Hz，H-2)；13C NMR(125 MHz，CDC13)δ：187.39(C-1)，134.3(C-2)，151.5(C-3)，137.0(C-1′)，128.9(C-3′，C-5′)，126.9(C-2′，C-6′)，128.5(C-4′)。以上數據和文獻[6, 7]報道一致，故確定該化合物為反式肉桂醛。

化合物3淺黃色粉末，mp. 245.8～246.7 ℃；ESI-MS：m/z295.2 [M+Na]+，271.1 [M-H]-；分子式為C15H12O5；IR(KBr)νmax3 406～3 129、2 926、2 847、1 706 cm-1；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.31(2H，d，J= 8.2 Hz，H-2′，H-6′)，6.78(2H，d，J= 8.2 Hz，H-3′，H-5′)，6.01(1H，s，H-8)，5.83(1H，s，H-6)，5.35(1H，dd，J= 11.4，2.0 Hz，H-2)，3.36(1H，d，J= 13.0 Hz，H-3a)，3.14(1H，d，J= 2.0 Hz，H-3b)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：79.7(C-2)，43.2(C-3)，196.7(C-4)，165.4(C-5)，98.3(C-6)，167.3(C-7)，95.9(C-8)，164.0(C-9)，102.7(C-10)，132.0(C-1′)，128.8(C-2′，C-6′)，115.5(C-3′，C-5′)，158.7(C-4′)。以上數據和文獻[8, 9]報道一致，故確定該化合物為柚皮素(結構見圖1)。

圖1 化合物3～9的化學結構Fig.1 The chemical structures of compounds 3-9

化合物4淺黃色針晶，mp. 181.2～183.6 °C；ESI-MS：m/z215.6 [M+Na]+；分子式為C10H8O4。IR(KBr)νmax3 335、1 704 cm-1；1H NMR(500 MHz，CDC13)δ：7.85(1H，d，J= 9.8 Hz，H-4)，7.09(1 H，s，H-5)，6.73(1H，s，H-8)，6.22(1H，d，J= 9.8 Hz，H-3)，3.79(3H，s，7-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CDC13)δ：164.1(C-2)，108.8(C-3)143.3(C-4)，102.7(C-5)，152.5(C-6)，145.1(C-7)，113.0(C-8)，150.6(C-9)，111.7(C-10)，57.7(7-OCH3)。以上數據和文獻[10]報道一致，故確定該化合物為異東莨菪素。

化合物5淡黃色粉末固體，mp. 146.9～149.1 ℃；ESI-MS：m/z217.4 [M+H]+，455.5 [2M+Na]+；分子式為C12H8O4；IR(KBr)νmax3 016、1 712 cm-1；1H NMR(500 MHz，CDC13)δ：7.38(1H，d，J= 8.9 Hz，H-4)，7.53(1H，d，J= 2.4 Hz，H-2′)，7.02(1H，s，H-5)，6.77(1H，d，J= 2.4 Hz，H-3′)，6.49(1H，d，J= 8.9 Hz，H-3)，4.15(3H，s，8-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CDC13)δ：160.9(C-2)，113.2(C-3)，143.5(C-4)，114.9(C-5)，126.1(C-6)，145.8(C-7)，136.6(C-8)，115.7(C-4a)，142.3(C-8a)，146.7(C-2′)，106.8(C-3′)，58.7(8-OCH3)。以上數據與文獻報道[11]一致，故確定該化合物為花椒毒素。

化合物6白色固體，mp. 223.7～226.2 ℃；與三氯化鐵反應呈陽性，提示含有酚羥基；HR-EI-MS：m/z181.165 8 [M+H]+(calcd for C9H9O4，181.166 1)；IR(KBr)νmax3 304～3 427、3 029、1 695、2 962、2 835、1 631、1 609、1 578、1 492 cm-1；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：10.29(1H，br s，7-OH)，9.28(1H，br s，5-OH)，6.69(1H，s，H-4)，5.18(2H，s，H-3)，2.36(3H，s，6-CH3)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：174.1(C-1)，71.2(C-3)，101.5(C-4)，156.1(C-5)，119.8(C-6)，159.2(C-7)，146.9(C-3a)，102.9(C-7a)，8.3(6-CH3)。以上數據與文獻報道[12,13]一致，故確定該化合物為6-甲基-5，7-二羥基苯酞。

化合物7白色粉末固體，mp. 114.2～116.7 ℃；ESI-MS：m/z285.3 [M+H]+；分子式為C14H20O6；IR(KBr)νmax3 329、3 016 cm-1；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：7.39(2H，dd，J= 8.6，8.2 Hz，H-3，H-5)，7.24(2H，d，J= 8.6 Hz，H-2，H-6)，7.01(1H，d，J= 8.2 Hz，H-4)，4.39(1H，d，J= 7.2 Hz，H-1′)，3.78(2H，t，J= 5.2 Hz，H-8)，3.71(1H，dd，J= 10.6，3.9 Hz，H-6′a)，3.56(1H，dd，J= 10.2，2.2 Hz，H-6′b)，3.43～3.21(4H，m，H-2′，3′，4′，5′)，2.87(2H，t，J= 5.2 Hz，H-7)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：136.2(C-1)，128.3(C-3，5)，126.9(C-2，6)，125.6(C-4)，34.2(C-7)，70.5(C-8)，103.3(C-1′)，74.1(C-2′)，75.9(C-3′)，76.8(C-4′)，71.3(C-5′)，62.5(C-6′)。以上數據與文獻[14,15]報道一致，故確定該化合物為2-苯基乙基-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物8白色結晶體，mp. 239～240 ℃；EI-MS：m/z431.2[M-H]；分子式為C21H20O10；IR(KBr)νmax3 528、3 387、1 669 cm-1；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：12.95(1H，br s，5-OH)，10.38(1H，br s，4′-OH)，7.95(2H，d，J= 8.6 Hz，H-2′，6′)，7.01(2H，d，J= 8.6 Hz，H-3′，5′)，6.90(1H，s，H-3)，6.85(1H，s，H-8)，6.45(1H，s，H-6)，5.19(1H，d，J= 7.2 Hz，H-1′′)，3.76(1H，dd，J= 11.2，3.8 Hz，H-6′′a)，3.61(1H，dd，J= 10.2，2.8 Hz，H-6′′b)，3.47～3.15(4H，m，H-2′′，3′′，4′′，5′′)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：164.2(C-2)，102.9(C-3)，182.3(C-4)，161.3(C-5)，101.7(C-6)，162.9(C-7)，96.9(C-8)，155.3(C-9)，104.8(C-10)，122.0(C-1′)，128.5(C-2′，6′)，117.4(C-3′，5′)，159.6(C-4′)，101.4(C-1′′)，72.8(C-2′′)，76.9(C-3′′)，70.4(C-4′′)，76.1(C-5′′)，61.3(C-6′′)。以上數據與文獻[16,17]報道一致，故確定該化合物為芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物9紅棕色粉末，mp. 156.9～159.2 ℃；EI-MSm/z：301.4 [M+H]+；分子式為C14H20O7；IR(KBr)νmax3 387、3 008 cm-1；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：7.07(2H，d，J= 8.6 Hz，H-2，H-6)，6.98(2H，d，J= 8.6 Hz，H-3，H-5)，4.31(1H，d，J= 7.2 Hz，H-1′)，3.78(1H，dd，J= 10.8，4.2 Hz，H-6′a)，3.84(2H，t，J= 4.9 Hz，H-8)，3.61(1H，dd，J= 10.0，2.0 Hz，H-6′b)，3.47～3.26(4H，m，H-2′，3′，4′，5′)，2.91(2H，t，J= 4.9 Hz，H-7)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：133.4(C-1)，129.2(C-2，6)，117.5(C-3，5)，155.9(C-4)，34.6(C-7)，70.3(C-8)，103.1(C-1′)，73.8(C-2′)，76.5(C-3′)，77.1(C-4′)，71.2(C-5′)，62.3(C-6′)。以上數據與文獻[18-20]報道一致，故確定該化合物為紅景天苷。

2.2 活性測試結果

化合物1～9的細胞毒活性測試結果見表1，化合物4對3種腫瘤細胞均具有不同程度的細胞毒活性，IC50< 50 μmol/L，其中，該化合物對測試人肺癌細胞A549的抑制活性最強，IC50為6.68 μmol/L；其它化合物對3種測試腫瘤細胞無明顯細胞毒活性。

表1 化合物1～9的體外細胞毒活性測試結果

3 結論

本文從旱芹菜根工業酒精提取物的乙酸乙酯萃取部位共分離和鑒定出9個化合物，包括糖苷類、香豆素類、黃酮、苯酞及其他類化合物，其中化合物3、4、6、7和9首次從該屬植物中分離得到。測試了化合物1～9對3種腫瘤的細胞毒活性，結果表明化合物4對3種腫瘤細胞均具有不同程度的細胞毒活性，對人肺癌細胞A549表現出較強的細胞毒活性，IC50值為6.68 μmol/L。據文獻報道[21]化合物4還對人乳腺癌細胞MCF和肝癌細胞HepG2也具有良好的細胞毒活性，IC50值分別為8.58 μmol/L和4.76 μmol/L。因此，化合物4可能是旱芹菜根作為抗癌藥物中的潛在有效成分，其作用機制及其體內藥效仍然有待于進一步深入研究。