實時熒光定量PCR 對社區暴露腹瀉樣本CA-CDI 的診斷價值

鄭瑞兵，張卉卉，應建飛，汪一萍

艱難梭菌（CD）屬于厭氧芽孢桿菌，能以芽孢形式長期存活于土壤或水環境中，經糞-口途徑傳播，是抗生素相關性腹瀉和醫療機構相關性腹瀉重要病原體之一[1]。艱難梭菌感染（CDI）患者常表現為腹瀉、伴或不伴腹痛及發熱等癥狀，輕中度癥狀具有自限性，重度及暴發型感染患者則易引發全身癥狀，威脅患者生命健康[2]。我國CDI 發病呈現逐年上升趨勢，作為我國丙類法定傳染病的重要病原體之一，CD的診斷與檢測技術評估，對疾病的二級預防具有重大意義[3-4]。社區獲得性艱難梭菌感染（CA-CDI）是指在醫院外罹患的CDI[5]。相關研究顯示，社區獲得性腹瀉中CDI 率為14%，培養陽性率為5%～6%[6]。CD 的毒性主要來源于兩大毒素，毒素A（tcd-A）為外毒素，結合腸黏膜刷狀緣以破壞其正常生理結構；毒素B（tcd-B）發揮細胞毒作用，破壞腸上皮細胞的細胞骨架結構從而形成偽膜[7]。本研究選取社區來源非重復腹瀉糞便標本，運用實時熒光定量PCR 法對tcd-B 基因進行擴增檢測，評估實時熒光定量PCR 法直接檢測糞便標本與“金標準”[產毒培養法（TC）+細胞毒性酶免疫分析（EIA）][8]診斷結果的差異，為進一步的CA-CDI 社區干預提供更多依據。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 樣本 選取2016年4-10月寧波市社區醫療機構就診的具有社區暴露史的腹瀉患者，符合：（1）腹瀉發病前6 周無住院經歷；（2）非重復有效腹瀉標本；（3）具有CDI 臨床診斷特征（危險因素+臨床表現）[9]；（4）社區暴露腹瀉樣本行CA-CDI檢測，以TC+EIA為“金標準”[10]。排除：（1）具有醫院暴露史；（2）重復腹瀉標本。最終獲得有效腹瀉標本329例，并及時進行厭氧培養。其中男191例，女138例；年齡3 ～81歲，平均（42.1±25.6）歲。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集與運輸 囑被檢測者于干燥清潔便盆內自然排便，以無菌采便管/盒挑取糞便中存在黏液、膿液或血液的部分4 ～6 g（液體糞便≥5 ml），4℃保存，24 h 內完成免疫學檢測。

1.2.2 檢測方法

1.2.2.1 實時熒光定量PCR 法（1）儀器與試劑：儀器選取實時熒光定量PCR儀（Cepheid，美國），試劑采用艱難梭菌熒光PCR 檢測試劑盒[（tcd-B）XY-DT-D-1330，xuanya]。（2）方法：拭子蘸取少量待測樣本插入含樣品處理液的小瓶后震蕩混勻，加樣后按照試劑盒說明書操作，將反應體系放入熒光PCR 儀進行擴增，并于退火/延長過程中記錄熒光信號。采用通用循環法，即以95℃10min 進行酶活化；95℃15s 進行變性，循環35 ～40 輪；60℃60s進行退火/延伸。（3）反應結束后，根據熒光信號與Ct 值判斷擴增結果。

1.2.2.2 TC+EIA 鑒定（1）CD 培養：取約0.2 ml 糞便標本與Eugon 肉湯（美國BBL公司）1∶1 混勻，并于80 ℃加熱10 min；接種環絲氨酸-頭孢西丁-果糖瓊脂平板（CCFA）和增菌肉湯，行35 ℃厭氧菌培養。如直接培養陰性可取變成紅色的肉湯轉移CCFA 繼續培養并鑒定；CD在CCFA上呈白色或淡黃色不透明的扁平狀“攤雞蛋樣”菌落，分離CD 菌株入－40 ℃低溫冰箱保存。（2）EIA 鑒定：采用毒素A+B 抗原ELISA 試劑盒（C.difficile toxins A+B ELISA，ELA4448 DRG，96T），檢測tcd-A、tcd-B。

1.3 統計方法 采用SPSS 22.0 統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，計數資料以n（%）表示，待評估檢測手段與“金標準”診斷結果差異性檢驗采用McNemar 檢驗，一致性檢驗采用Kappa 分析。

2 結果

2.1 329例社區暴露腹瀉標本CA-CDI檢測情況 艱難梭菌熒光PCR 檢測共檢測tcd-B陽性14例，陽性率為4.26%；其中包括1例熒光PCR 檢測CA-CDI（+）但培養（－）標本。排除1例培養（+）但EIA 鑒定陰性標本，TC 法共獲得產毒CD 17 株（5.17%），陽性菌株ELISA法定性測定毒素基因tcd-A 和tcd-B，15株標本為tcd-A（+）、tcd-B（+）樣本；1 株為tcd-A（－）、tcd-B（+），1 株為tcd-A（+）、tcd-B（－）。

2.2 兩種檢測法對CA-CDI 檢測效能比較 艱難梭菌熒光PCR 檢測試劑盒（tcd-B）對CA-CDI 檢測結果與“TC+EIA 鑒定”結果差異無統計學意義（P=0.375，雙側檢驗），一致性檢驗Kappa 值為0.831。艱難梭菌熒光PCR 檢測試劑盒（tcd-B）對CA-CDI 檢測靈敏度為76.47%，特異度為99.68%，見表1～2。

表1 實時熒光定量PCR與產毒培養對CACDI 檢測結果比較 例

2.3 兩種檢測法對tcd-B檢測效能比較艱難梭菌熒光PCR 檢測試劑盒（tcd-B）對tcd-B 檢測結果與“TC+EIA 鑒定”結果差異無統計學意義（P=0.625，雙側檢驗），一致性檢驗Kappa 值為0.860。艱難梭菌熒光PCR 檢測試劑盒（tcd-B）對tcd-B 檢測靈敏度為81.25%，特異度為99.68%，見表2～3。

表2 實時熒光定量PCR 對不同診斷目標的檢測效能參數 %

表3 實時熒光定量PCR 與產毒培養對產毒基因tcd-B 檢測結果比較例

3 討論

CDI 是腸道菌群失調，進而產毒性CD大量繁殖并產生毒素導致的[11]。以往研究多著眼于醫院CDI 的檢測與治療，關于的CA-CDI 研究相對較少[12-13]。本研究就是著眼于CA-CDI，分析在社區暴露腹瀉患者群體中，病原分子生物學檢測手段的檢測效能。

現有的CDI 檢測技術包括糞便厭氧培養、EIA、谷氨酸脫氫酶（GDH）檢測及熒光定量PCR 檢測等[14]。本研究選取實時熒光定量PCR 為主要待評估檢測手段，以TC+EIA 為“金標準”進行比較，結果顯示，艱難梭菌熒光PCR 檢測試劑盒（tcd-B）檢測CA-CDI 陽性率為4.26%；“金標準”檢測CA-CDI 陽性率為5.17%（17/329），與以往研究中1%～7%的人群攜帶率相符[15]。出現1例實時熒光定量PCR 檢測樣本tcd-B（+）但培養（－）標本，考慮為運輸及保存過程中空氣暴露時間過長引起的假陰性結果。另有1例TC 法對樣本CA-CDI 檢測中培養（+），但進一步EIA 檢測顯示均為陰性，考慮源于TC 無法區分產毒與非產毒CD 的檢測缺陷導致[16]。艱難梭菌熒光PCR 檢測試劑盒（tcd-B）對社區暴露腹瀉樣本CA-CDI診斷靈敏度與特異度分別為76.47%和99.68%；對tcd-B 檢測靈敏度與特異度分別為 81.25%和99.68%；與“金標準”檢測一致性分別達到0.831 和0.860。這說明社區暴露腹瀉樣本CA-CDI 產毒基因tcd-B 的實時熒光定量PCR 檢測效能較高，可代替TC 進行快速的獨立檢測。

總之，實時熒光定量PCR 技術檢測糞便樣本，具有簡單快捷且準確率高等優點，對CA-CDI診斷效能良好，方便在基層醫療單位廣泛應用。