碳青霉烯耐藥銅綠假單胞菌株中耐藥基因的表達及對多黏菌素異質性耐藥的研究

許磊，王廣芬，金雨虹，周妃妃，國建

銅綠假單胞菌（PA）是院內感染中常見的條件致病菌之一。在免疫功能低下、長期臥床及燒傷等患者中，PA 具有較高分離率，并可引起全身性感染等嚴重并發癥[1]。碳青霉烯類抗生素是治療PA 的首選抗菌藥物之一。但隨著其廣泛應用，在臨床逐漸檢出碳青霉烯耐藥銅綠假單胞菌（CRPA），給抗感染治療帶來極大困難，并造成不良的預后[2-3]。多黏菌素被認為是治療多重耐藥革蘭陰性菌的最終選擇。但多黏菌素在鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌等臨床治療中存在異質性耐藥，往往造成抗感染治療失敗[4-5]。本研究對97 株CRPA 進行耐藥基因檢測與分析，并檢測CRPA 對多黏菌素異質性耐藥的頻度，為臨床治療提供依據。報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2019年1月至2020年2月寧波市醫療中心李惠利醫院住院患者中分離的CRPA 97 株，排除同一患者重復菌株。所使用的標準菌株為銅綠假單胞菌（ATCC27853）和大腸埃希菌（ATCC25922），均購于美國ATCC公司。

1.2 藥物試劑及儀器 抗生素亞胺培南、美羅培南、多黏菌素、比阿培南、頭孢他啶、左氧氟沙星、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦，購于Sigma 公司（上海）。肉湯培養基和Mueller-Hinton 瓊脂平板購自OXOID公司（英國）。VITEK 2 Compact 全自動細菌鑒定及藥敏分析系統、濁度儀為法國梅里埃公司產品；PCR 儀為美國BIO-RAD 公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種鑒定 參考《全國臨床檢驗操作規程》方法對菌株進行培養、分離和鑒定，并根據美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI）標準分析結果，篩選CRPA。

1.3.2 耐藥基因檢測 所提取的菌株，經煮沸5 min 提取菌株總DNA。碳青霉烯酶相關基因（IMP、VIM、SIM、

GIM、SPM、NMD、OXA-1、OXA-2、OXA-10）及外膜蛋白（Opr）基因OprD2的特異性DNA 通過PCR 方法來測定。PCR 擴增體系為：模DNA 共計2 l，上下游引物各0.5 l，2×Taq PCR MasterMix 10 l（夠自美國NewEnglandBioLab 公司），純水7 l。PCR 儀器條件：94 ℃預變性10 min，94 ℃變性20 s，60 ℃退火10s，72℃延伸60 s，共40個循環。擴增完畢后，在瓊脂糖凝膠中電泳成像。所用引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成，見表1。

表1 PCR 引物序列及擴增產物長度

1.3.3 藥物敏感性檢測 將待測菌株與質控菌株分別在Mueller-Hinton 瓊脂平板上37℃孵育過夜。制備0.5 麥氏上樣菌液。配制12個濃度梯度的多黏菌素溶液，最高濃度為256 g/ml，依次將上樣菌液加入96 孔板，37℃培養20 h。以上均在無菌條件下完成。根據美國CLSI2014 的標準[最小抑菌濃度（MIC）≤2 g/ml 表示敏感，MIC=4 g/ml表示中介，MIC ＞4 g/ml 表示耐藥]來對判定菌株對多黏菌素敏感性。

1.3.4 群體譜分析 根據MIC 挑選對多黏菌素敏感的25 株進行群體譜分析。分別配制含有不同濃度多黏菌素（0、1、2、4、8、16、32 及64 g/ml）的Mueller-Hinton 瓊脂平板。將0.5 麥氏菌液稀釋8個梯度濃度，并植于Mueller-Hinton 瓊脂平板上，37℃培養過夜。培養結束后計數生長菌落。取在最高濃度多黏菌素（64 g/ml）平板上生長的菌落，經無藥平板培養傳代72 h后，再次測定MIC。MIC＞2 g/ml 濃度多黏菌素平板上生長的菌株為具有異質性耐藥的菌株；此外，至少≥2倍MIC 濃度，但≤2 g/ml 濃度的多黏菌素平板上生長的菌株，定義為異質性[6]。

1.3.5 聯合用藥試驗 選取6 株異質性耐藥菌株以及相對應的原始菌株，同時選取6 株無異質性的菌株，進行體外藥敏試驗。抗生素的組合方案為：多黏菌素分別聯合比阿培南、頭孢他啶、左氧氟沙星、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦進行藥敏試驗。以4 倍根據藥物單獨MIC 作為最高濃度，并進行8個梯度稀釋，每兩種藥物1∶1 按降梯度方向加入96 孔板，37℃培養24 h，并計算部分抑菌濃度指數（FICI）。結果判定標準為：協同作用為FICI≤0.5，相加作用為0.5 ＜FICI≤1，無關作用為1 ＜FICI≤2，拮抗作用為FICI ＞2[7]。

1.4 統計學處理 用SPSS 25.0（美國IBM 公司）軟件進行數據分析。

2 結果

2.1 菌株的基本特征 共在97例住院感染患者中收集97 株無重復CRPA。其中男52例，女45例；60歲及以上58例，60歲以下39例。菌株主要來源于體液（包括痰液、肺泡灌洗液、尿液、血液、分泌物以及引流液等），其中痰液中占比最高。患者住院科室主要分布于ICU（最常見）、呼吸內科、感染科和外科。

2.2 基因檢測結果 通過PCR 驗證：IMP 陽性20 株（20.61%），VIM 陽性11株（11.34%），SPM 陽性9 株（9.27%），OXA-10 陽性17 株（17.53%），OprD2 缺失62 株（63.92%）。

2.3 CRPA 多黏菌素MIC 值分布 95株（97.94%）對多黏菌素敏感，僅2 株呈中介，無耐藥菌株。見表2。

表2 CRPA 多黏菌素MIC 值分布

2.4 CRPA群體譜分析 在用于群體分析的25 株CRPA 中，8 株（32.00%）存在異質性耐藥，5 株（20.00%）具有異質性，12 株（48.00%）無異質性。見表3。

表3 CRPA 群體譜分布

2.5 聯合用藥結果 異質性耐藥菌株4+、47+、65+，75+，77+，78+及其相對應的原始菌株表現出以協同作用和相加作用為主，部分卻表現出無關作用。無異質性的菌株21、45、57、80、90、93 表現為協同作用、相加作用和無關作用。所有檢測的菌株均沒有出現拮抗作用。多黏菌素+比阿培南聯合作用最佳，有66.67%（12/18）的菌株表現為協同作用，33.33%（6/18）的菌株表現相加作用。而多黏菌素+頭孢哌酮/舒巴坦聯合作用表現最差，只有22.22%（4/18）的菌株表現為協同作用。見表4。

表4 聯合用藥FICI

3 討論

PA耐青霉烯類的主要機制為酶的生成，孔蛋白的缺失或主動內流[8]。PA 產生的青霉烯酶主要有 B 類金屬酶（MBL，主要包括IMP、VIM、SIM、GIM、SPM、NMD）和D 類苯唑西林酶（OXA，包括OXA-1、OXA-2、OXA-10 等）。與文獻[9]報道相似的是，本研究共收集97株CRPA 的結果提示IMP、VIM 和SPM可能是導致CRPA 耐藥性的主要金屬酶。此外，OXA-10 是引起CRPA 耐藥的主要OXA 類型。

-內酰胺類抗生素需要經過細菌外膜的水通道Opr 進入細菌內[10]。OprD2是碳青霉烯類的特異性通道，缺失或不表達會此蛋白的PA 對碳青霉烯類抗生素耐藥[11]。OprD2 進行PCR 擴增的結果顯示，OprD2 缺失菌株 62 株（63.92%），因此推測CRPA 耐藥性可能與OprD2 缺失有關。

本研究對97 株CRPA進行多黏菌素敏感性實驗，其中95 株（97.94%）對此抗生素敏感，這表明多黏菌素對CRPA具有高度敏感性[12]。但需要臨床醫生重視的是，CRPA 對多黏菌素異質性現象也逐漸凸顯[13]。本研究對25 株不同MIC 分布的CRPA 進行群體譜分析，結果顯示8 株（32.0%）存在異質性耐藥，5 株（20.00%）存在異質性。這表明多黏菌素治療CRPA具有一定的潛在耐藥的風險，其異質性及異質性耐藥可能使臨床抗感染治療更加困難，在臨床治療中應加以重視。

由于CRPA 對碳青霉烯類的耐藥性，及部分CRPA 菌株對多黏菌素異質性或異質性耐藥，同時增加多黏菌素劑量后腎毒性的發生率也相應增加，故而采用多黏菌素為主聯合其他抗生素治療有一定的理論優勢[14]。以往研究表明，多黏菌素聯合治療碳青霉烯耐藥性或產生碳青霉烯酶的革蘭陰性菌感染，同單用多黏菌素治療組相比較，有顯著的生存優勢[15]。本研究聯合用藥實驗中，多黏菌素與比阿培南聯合應用抗菌效果最佳，這表明多黏菌素聯合用藥（特別是聯合比阿培南）有助于防止異質性發展為耐藥性。

綜上所述，耐藥性基因的表達可能是CRPA產生抗生素耐藥的機制。CRPA對多黏菌素的敏感性仍很高，但對多黏菌素異質性或異質性耐藥仍然存在。聯合應用抗生素可能有效殺滅CRPA并預防其多多黏菌素的耐藥。